Введение к работе
Актуальность проблемы. Направленное уничтожение клеток определенного типа является одной из важных задач атиотроішой терапии различных заболеваний.
Цитотоксинн - это новый тшг фармакологических препаратов, ггозволяпций избирательно убивать клетки мишени. Как правило, они представляют собой гибридные молекулы состоящие из токсического и адресного фрагментов. В качества адресного фрагмента цитотоксинов успешно используют Л6КТИВЫ, гормоны, антитела и их Уаъ-фрагменты. В качестве токсических фрагментов используют токсины растительного и бактериального происхокдения (^ абрин, рицин, модэцин ). Это наиболее хорошо изученный тип цитотоксинов. Кроме того, широко исследуется направленная доставка к клеткам-мишеням ферментативно-активных веществ ( например, глюкозооксидази, .генерирующей перекись водорода), лекарственных препаратов таких как антиштаболиты (метотрексат), алкилирувдие агенты (хлорамбуцил), некоторые антибиотики.
Использование низкомолекулярных генераторов активных форм кислорода в качества токсических фрагментов цитотоксинов - это новий подход к направленному разрушению клеток-мишеней, позволяющий сочетать точную клеточную адресацию с широким спектром возможных повреждений.
Известно, что в организме активные формы кислорода осуществляют окислительную модификацию и деградацию структурных и транспортных белков, ферментов, нуклеиновых кислот, инициируют
перекисное окисление ненасыщенных лшгвдов, вызывают повреждение Оиомембран (Pligiel et ai., 1984; Halliwell & Cutteridge, 1984; Pi-idovinh. 1986; Him et al., 1988; Archakov & Bactananova, 1990 ). Довольно хорошо изучено цитотокснтаское действие активных форм кислорода на различные виды клеток: фагоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, культуры опухолевых клеток и т.д. ( Badwey & Kamoveky, 1980; Nathan & Cohn, 1980; Weiss & Lobuglio, 1982; Wiiorton et al., 1985 ).
В качестве низкомолэкулярного генератора активных форм кислорода нами был выбран. ашжбиотик бдеомицин, относящейся к классу гликопешэдов. Блеомицин, хелатаруя металлы переменной валентности, генерирует активные формы кислорода в окислительно - восстановительном цикле, подобном монооксигеназному циклу цитохрома Р-450 (Burger et al., 1933; Murugesan et al, 1983). Ыолвкулой-мишаньв в клетке для блеомицина является ДНК: интеркалируя в молекулу ДНК, блеомицин генерирует разрушающие ДНК активные формы кислорода (Stubbe, 1988). Помимо разрывов ДНК, блеомицин может оказывать повреждающее действие на мембранные структуры клеток за счет инициации перекислого окисления липидов, с последувдей агрегацией белков (Giri et al., 1983; Omaye and Tappel, 1984; Rosen et al., 1933).
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлось получение активных конъюгатов блеомицина с адресными молекулами, обладающих способностью разрушать эритроциты более эффективно, чем свободный блеомицин.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие
задачи:
-
Исследовать повреэодащее действие блеомицина на эритроциты с целью выяснения вида активных форм кислорода участвующих в этом процессе и возможности использования в нем различных доноров редокс-зквивалентов.
-
Разработать метод ковалентного связывания блеомицина с белком с сохранением его способности активировать молекулярный кислород.
-
Получить активные конъюгаты блеомищша с конканавалином А, алтизритроцитарным Ig о и его їаЬ-фрагментом, обладающие высоким сродством к поверхности эритроцитов.
-
Провести сравнительное исслэдование гемолитической активности полученных коныогатов и свободого блеомицина.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что низкомолекулярный генератор активных форм "кислорода блэомицин предлагается использовать в качестве киллерного фрагмента при создании циготоксинов.
В результате проведенных исследований обнаружено, что комплекс блеомицина с железом, генерируя активные формы кислорода, способен повреждать эритроцитарнне кембранн. Необходимые для этого электроны яелззо может получать от аскорбиновой кислоты, перекиси водорода. Кроме того, возможно ферментативное восстановление железа NADPH-цитохром Р-450 редуктазой.
Подобраны условия ковалентного связывания блеомицина с балками, при которых Олеомицин сохраняет способность хелатировать железо и разрушать клеточные мембраны.
Получены конъюгаты блеомицина с адресннш фрагментами
конкаыаваливом А, штизритроцитарным иммуноглобулином G и Fab-фрагментом, обладавдие более высокой гемолитической активностью по сравнению со свободным блеомиодном.
Апробация дисс&ртащш состоялась 29.01.92 г. на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии юБ5 PIW и Института биологической и медицинской химии РАМН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем работы, диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 29 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования и их обсуадения, выводов и списка цитируемой литературы.