Введение к работе
Актуальность проблемы. Направленное уничтожение клеток определенного типа является одной из важных задач этиотропной терапии различных заболеваний.
Цнтотоксины - это новый тип фармакологических препаратов, позволяющий избирательно убивать клетки мишени. Как правило, они представляют собой гибридные молекулы состоящие из токсического и адресного фрагментов. В качестве адресного фрагмента цитотоксинов успешно используют лектины, гормоны, антитела и их ?аъ-<й>агменты. В качестве токсических фрагментов используют токсины растительного и бактериального происхождения ( абрин, рицин, модецин ). Это наиболее хорошо изученный тип цитотоксинов. Кроме того, широко исследуется направленная доставка к клеткам-мишеням ферментативно-активних веществ ( например, глюкозооксидази, генерирующей перекись водорода), лекарственных препаратов таких как антиметаболиты (метотрексат), алкилирующие агенты (хлорамбуцил), некоторые антибиотики.
Использование низкомолекулярных генераторов активных форм кислорода в качестве токсических фрагментов цитотоксинов - это новый подход к направленному разрушению клеток-мишеней, позволяющий сочетать точную клеточную адресацию с широким спектром возможных повреждений.
Известно, что в организме активные формы кислорода осуществляют окислительную модификацию и деградацию структурных и транспортных белков, ферментов, нуклеиновых кислот, инициируют
перекиснов окисление ненасыщенных липидов, вызывают повреждение биомембран (Fligiel et al., 1984; Halliwell & Gutteridge, 1984; Fridovioh, 1986; Him et al., 1988; Archakov & Bachmanova, 1990 ). Довольно хорошо изучено цитотоксическое действие активных форм кислорода на различные виды клеток: фагоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, культуры опухолевых клеток и т.д. ( Badwey & Karnovsky, 1980; Nathan & (John, 1980; Weiss & Lobuglio, 1982; Whorton et al., 1985 ). -
В качестве низкомолекулярного генератора активных форм кислорода нами был выбран антибиотик блеомицин, относящийся к классу гликопептидов. Блеомицин, хелатируя металлы переменной валентности, генерирует активные формы кислорода в окислительно - восстановительном цикле, подобном монооксигеназному циклу ЦИТОхрома Р-450 (Burger et al., 1983; Murugesan et al, 1983). Ыолекулой-мишенью в клетке для блеомицина является ДНК: интеркалируя в молекулу ДНК, блеомицин генерирует разрушающие ДНК активные формы кислорода (stubbe, 1988). Помимо разрывов ДНК, блеомицин может оказывать повреждающее действие на мембранные структуры клеток за счет инициации переписного окисления липидов, с последующей агрегацией белков (Giri et al., 1983; Omaye and Tappel, 1984; Rosen et al., 1983).
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлось получение активных конъюгатов блеомицина с адресными молекулами, обладающих способностью разрушать эритроциты более эффективно, чем свободный блеомицин.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие
задачи:
-
Исследовать повреждающее действие блеомицина на эритроциты с целью выяснения вида активных форм кислорода участвующих в этом процессе и возможности использования в нем различных доноров редокс-эквивалентов.
-
Разработать метод ковалентного связывания блеомицина с белком с сохранением его способности активировать молекулярный кислород.
-
Получить активные конъюгаты блеомицина с конканавалином А, антиэритроцитарным Ig с и его РаЬ-фрагментом, обладающие высоким сродством к поверхности эритроцитов.
-
Провести сравнительное исследование гемолитической активности полученных коныогатов и свободого блеомицина.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что низкомолекулярный генератор активных форм кислорода блеомицин предлагается использовать в качестве киллерного фрагмента при создании цитотоксинов.
В результате проведенных исследований обнаружено, что комплекс блеомицина с железом, генерируя активные формы кислорода, способен повреждать эритроцитарные мембраны. Необходимые для этого электроны железо может получать от аскорбиновой кислоты, перекиси водорода. Кроме того, возможно ферментативное восстановление железа NADPH-цитохром Р-450 редуктазой.
Подобраны условия ковалентного связывания блеомицина с белками, при которых блеомицин сохраняет способность хелатировать железо и разрушать клеточные мембраны.
Получены- конъюгаты блеомицина с адресными фрагментами
конканавалином А, антиэритроцитарным иммуноглобулином с и Fab-фрагментом, обладающие более высокой гемолитической активностью по сравнению со свободным блеомицином.
Апробация диссертации состоялась 29.01.92 г. на совместном заседании учебно-научного комплекса кафедры биохимии МВФ РГМУ и Института биологической и медицинской химии РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы л 29 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, экспериментальной части с результатами исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.