Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы удалось выяснить некоторые крайне интересные биохимические взаимосвязи между метаболизмами глутамата, аргинина, орнитина и пролина. Эти аминокислоты служат не только строительными блоками при синтезе белков, но и предшественниками многих биомолекул, выполняющих различные специализированные функции.
Пути биосинтеза этих родственных аминокислот, по-видимому, в целом идентичны для псех форм живого и осуществляются через общие промежуточные продукты. Тем не менее их роль в метаболизме клетки весьма специфична и далеко еще окончательно не раскрыта. Следует отметить, что гормон гипоталамуса тиролиберин является трипептидом, состоящим из пирроглутаминовой кислоты (оксопролина), гистидина и пролинамида. Люлиберин же являясь декапептидом содержит пирроглутаминовую кислоту и пролин.
В последнее время интенсивно изучается энергетическая роль пролина при полете насекомых Имеются достоверные данные о коррелятивном уменьшении содержания пролина и, наоборот, возрастании содержания глутамата и аланина (Weeda et al, 1980).
Доказано включение пролина в состав коллагена, особенно при заживлении термических ран у крыс (Rama Rao, Mestra, 1980) и при регенеративных и восстановительных процессах у дождевого червя (Давтян и др., 1982).
Более того, установлено (Давтян и др., 1982), что при повышении потребности и пролине индуцируется неуреотелическая аргиназа с целью обеспечения его биосинтеза из необходимого предшественника - орнитина. В этом отношении уникальной является корреляция между активностью аргиназы и ферментами биосинтеза пролина при регенерации дождевого червя, когда налицо потребность организма в пролине и заметно .усилены восстановительные и пролиферативные процессы.
Имеется довольно много убедительных данных относительно взаимосвязи между обменом аргинина и пролина. Наблюдается интенсивный синтез пролина на фоне возрастания активности аргиназы в опухолевых тканях мышей и значительное ингибирование активности аргиназы пролином (Kesava Rno el а), 1974). По-видимому, интенсивное расходование свободного пролина приводит к эффективной пролиферации клеток.
Относительно мозга мышей (Johnson, Roberts, 1984] установлен механизм транспорта аргинина вовнутрь синаптосом, егс превращение в орнитин, глутамат, ГАМК и пролин.
В литературе почти нет данных о метаболизме пролина і различных отделах мозга.
Наши исследования в определенной степени разъясняют отдельные стороны метаболизма пролина п мозжечке крыс и выявляют регуляторные возможности ферментов биосинтезе пролина - орнитин-5-трансаминазы (ОТ) и пирролин-5-карбоксилаі редуктазы (П5КР).
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение процесса биосинтеза пролина и характеристика ферментов ОТ и П5КР, катализирующих указанный процесс Изучены следующие вопросы:
1. Установлены предшественники биосинтеза пролина и
внутриклеточная локализация ферментов биосинтеза пролина е
мозжечке крыс.
2. Исследовано влияние адениловых нуклеотидов и
аминокислот на ферменты биосинтеза пролина мозжечка крыс.
3. Осуществлена очистка ферментов биосинтеза пролина
мозжечка крыс и изучены их регуляторные свойства.
4. Изучено влияние окисленных нуклеотидов и органических
кислот на ферменты биосинтеза пролина мозжечка крыс.
5. Выявлены ферменты окисления пролина в мозжечке крыс.
Научная новизна. Впервые изучены ферменты биосинтеза
пролина мозжечка крыс. Получены ОТ и П5КР мозжечка крыс со степенью очистки 53,1 и 700 соответственно. Доказано пигнбирование активности П5КР окисленными НАДФ И НАД.
Осуществлен биосинтез пролина в присутствии окисленных нуклеотидов (НАД и НАДФ) и органических кислот (цитрат, изоцитрат, малат). Впервые изучено окисление пролина в мозжечке крыс и ингибирование этого процесса п-ХМБ и гидроксиламином .
Практическая ценность. Полученные данные о синтезе пролина с участием окисленных нуклеотидов и органических кислот, в первую очередь цитрата, на уровне гомогената могут быть применены для усиления синтеза этой аминокислоты в клетке.
Результаты данной работы можно использовать для препаративного получения ферментов биосинтеза пролина - ОТ и П5КР.
Апробация работы. Материалы диссертации в виде отчетов іжєгодно обсуждались на Ученом Совете Института биохимии НАН Армении (1994-1997).
Публикации. Всего по теме диссертации опубликовано 4 іаучньїе работы.
Объем работы. Диссертационная работа напечатана на 95 траницах машинописного текста и состоит из введения, обзора лтературы, материала и методов исследования, собственных [сследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа ключает 17 таблиц и 8 графиков.
Библиографический указатель содержит 138 источников.
Объектом исследований служили белые крысы линии Вистар іассой 150-180 г
Приготовление гомогената. Готовили 20% гомогенат мозжеч-а крыс на 0,1 М калий-фосфатном буфере в стеклянном гомогени-аторе типа Поттера-Эльведжейма. Для определения ферментов био-интеза и окисления пролина были использованы рН 7,4 и 8,0 соот-етственно. Гомогенаты центрифугировали при 27 000д в течение 30 ин.
Определение активности ОТ и П5КР. Инкубационная смесь 5 мл) содержала 50 мкмоль L-орнитина, 20 мкмоль а-КГ, 100 мкмоль алий-фосфатного буфера (рН 7,4), 1 мкмоль пиридоксаль-5-фосфата 0,5 мл гомогената мозжечка. Инкубация проводилась при 37С в гчение 1 часа. За это время орнитии под действием ОТ среды преп-ащается в пирролин-5-карбоксилат. Затем в среду добавлялось мкмоль НАДН или НАДФН и 0,5 мл свежего гомогената, смесь ин-убировалась еще 15 мин. Под действием П5КР П5К превращается в ролин.
Реакцию останавливали холодным этиловым спиртом (96) ри хромотографическом определении пролина и 20% ТХУ - при хи-ическом определении. Пробы центрифугировались при 8 000 5/мин в течение 10 мин, после чего определялся пролин. Актив-эсть ферментов биосинтеза пролина (ОТ и П5КР) выражалась в кмолях образовавшегося пролина на 1 г свежей ткани.
Определение активности ПО и П5КА. Осадок гомогенатов, элученный центрифугированием при 27 000д в течение 30 мин, істворяли в 4 мл 0,01 М Трис-HCl буфера, содержащего 0,5 М
ЭДТА (рН 8,2) и центрифугировали при 27 ОООд 30 мин. 3tj процедуру повторяли 3 раза. В последний раз к осадку добавлял* 10% этиловый спирт, замораживали, оттаивали и центрифугировал} при 27 ОООд 30 мин, раствояли в 0,01 М Трис-HCl буфере (с ЭДТА рН 8,2) и использовали в качестве ферментного препарата обладающего ПО и П5КД активностями.
Инкубационная смось в 1,9 мл содержала: 53 ммоль калій фосфатного буфера (рП 8,0), 0,2 ммоль L-иролшш, 1,0 мкмолі цитохрома С и 4 мкмоль НАД. Инкубацию проводили при 37С і течение 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 96% холодногс этилового спирта в соотношении 1:1. Осадок удалял*: центрифугированием при 12 000д в течение 10 мин. Об активностяэ ПО и П5КД судили по синтезу глутамата.Содержание глутамате определяли методом бумажной хроматографии. Плотность окраска определяли путем фотометрирования на фотокалориметре типе КФК-2 с зеленым фильтром.
Определение пролина проводилось по Блюменкрантщ (Blumenkrantz, 1980). Чувствительность метода составляет 1 мкг. К 1 мл образца добавляли 1 мл пингидриноиого реагента (3 і шшгидрина в 180 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл формалина) Смесь кипятили 1 мин при 100С или 4 мин при 75С, охлаждал* льдом и измеряли красную окраску спектрофотометром при 515 нм В качестве стандарта применяли пролин в концентрации 2 мкг/мл.
Гель-фильтрация, Для выявления изоэнзимиого спектр? ферментов биосинтеза пролина проводилась гельфильтрацш бесклеточного экстракта мозжечка крыс на сефадексе G-150. Для получения экстракта гомогенат центрифугировался при 27 000д в течение 30 мин. На колонку наносилось 3 мл бесклеточногс экстракта. Уравновешивание и элюция осуществлялись 0,005 Ni Трис-HCl буфером, рН 7,4. Скорость элюции - 30 мл/час. Объе* фракций - 5 мл. Была собрана 21 фракция.
Очистка ОТ и П5КР мозжечка крыс была осуществлена пс разработанной нами методике.
Белок определяли по методу Лоури и сотр. (Lowry et al, 1951] и спектрофотометричоскп по интенсивности поглощения света при 280 нм на СФ-4А.