Введение к работе
Актуальность исследования.
Лигнин - сложный, трехмерный, нестереорегулярный полимер ароматической природы. Он является обязательным структурным компонентом всех высших сосудистых растений и составляет от 20 до 35 % сухого веса их биомассы. Широкое распространение лигнина неизбежно вовлекает его в сферу хозяйственной деятельности человека. Сложное строение лигнина обуславливает его устойчивость к химическому и микробиологическому разложению и создает ряд проблем при переработке лигноцеллюлозного сырья.
Интенсивные поиски путей переработки и утилизации липшнеодержащих отходов выявили, что к полной биодеградации лигнина способны лишь так называемые грибы "белой гнили". Биодеградация лигнина, осуществляемая ими, многоступенчатый и полиэнзиматический процесс, зависящий от множества факторов, в котором участвуют как окислительные, так и гидролитические ферменты. Основные исследования по энзимологии разложения лигнина был:? проведены с грибом Phanerochaete chrysosporium, из глубинной культуры которого были выделены, очищены и охарактеризованы ферменты, инициирующие процесс деградации лигнина: лигнинпероксидаза, Mn-зависимая пероксидаза, а также ряд вспомогательных ферментов, например, перекись-генерирующие (глюкозооксидаза, гли-оксальоксидаза и др.). При этом роль ключевого фермента отводилась лигнинпе-роксидазе. Однако, накопленные за последнее десятилетие данные по другим липшнразрушающим грибам - Coriolus (Trametes) versicolor, Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Panus (Lentinus) tigrinus и ряд др., свидетельствуют о том, что, помимо лигнинпероксидазы, роль ключевого фермента может выполнять Мп -пероксидаза, лакказа или пероксидаза.
На кафедре биотехнологии Мордовского госуниверситета был выделен высокоактивный лигнолитический гриб Panus (Lentinus) tigrinus BKM-F-3616D. Однако механизмы биодеградации лигнина данным грибом и ферменты, вовлеченные в лигнолизис, практически не исследовались.
Цели и задачи исследования.
Изучить состав, а также динамику и характер биосинтеза ферментов внеклеточного лигнолитического комплекса гриба Panus tigrinus при различных условиях культивирования. Выделить и охарактеризовать физико-химические свойства лакказы и пероксидазы гриба Panus tigrinus. ' В задачи исследования входило:
1. Провести сравнительный анализ биосинтеза отдельных ферментов грибом
при твердофазном и глубинном культивировании.
-
Изучить динамику биосинтеза лигнолитических ферментов грибом при твердофазном культивировании на природных и модифицированных лигноцел-люлозных субстратах.-
-
Разработать условия для максимального биосинтеза этих ферментов при глубинном культивировании.
4. Выделить и охарактеризовать лигнолитические ферменты гриба Panus ti-
grinus.
Научная новизна.
Впервые исследован состав лигнолитического ферментного комплекса гриба Panus tigrinus штамм BKM-F-3616D. Показано, что данный гриб синтезирует Мп-пероксидазу, пероксидазу и лакказу, а также перекись-генерирующий фермент -глюкозооксидазу, в условиях глубинного культивирования. При твердофазном культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб синтезирует преимущественно пероксидазу и лакказу. Из глубинной культуры гриба выделены и охарактеризованы два фермента лигнолитического комплекса - лакказа и пероксида-за. Показано, что гриб синтезирует, по крайней мере, две изоформы оксидаз, одна из которых относится к желтым оксидазам. Впервые для грибов Panus tigrinus выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. -Начно-практическая значимость работы.
Результаты исследования позволяют расширить представления о внеклеточном лигнолигическом ферментном комплексе ірибов Panus tigrinus.
Данные могут быть использованы для получения ферментов лигнолитического комплекса гриба Panus tigrinus ВКМ F-3616 D. Активная культуральная жидкость может быть использована для модификции лигнсшеллюлозного материала с целью дальнейшего производства древесных пластиков. Публикация и апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Рациональное использование лесных ресурсов» и на Всероссийской конференции «Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья». По материалам исследований опубликованы 2 тезиса и 1 статья принята в печать журналом «Биохимия». Структура и объем работы.
Диссертация изложена на /^ страницах и состоит из введения, обзора ли
тературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключе
ния и списка литературы. Библиографический указаіель включает источника.
Положения, выносимые на защиту.
-
Гриб Panus tigrinus ВКМ F-3616 D обладает высокой лигнолитиче-ской активностью, что делает перспективным использование его для биодеградации лигнина и биомодификации древесного сырья для производства древесных пластиков.
-
Лигнолитический ферментный комплекс гриба включает набор окислительных ферментов - пероксидаз и оксидаз и перекись-генерируюший фермент глюкозооксидазу.
-
При культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб синтезирует преимущественно лакказу и пероксидазу. Лакказа, вероятно, играет ведущую роль в процессах липюлизиса данным грибом. Пе-роксидаза дополняет действие лакказы и, вероятно, участвует в де-токсикации продуктов деградации лигнина.
-
Разработаны оптимальные условия для биосинтеза литнолитических ферментов грибом в условиях культивирования на жидких питательных средах.
-
Гриб Panus tigrinus ВКМ F-3616 D синтезирует несколько изоформ оксидаз, одна из которых, вероятно, относится к желтым лакказам.
-
Впервые для грибов Panus tigrinus охарактеризована пероксидаза, подобная иероксидазам растений.