Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
2.1. Локализация ФПФаз II
2.2. Субстратная специфичность ФПФаз . II
2.3. Множественные формы ФПФаз . 14
2.4. Субъединичная структура ФПФаз 17
2.5. Углеводсодержащие кислые ФПФазы . 22
2.6. ФПФазы клеточных ядер 24
2.7. Классификация ФПФаз 26
2.8. Термостабильные регуляторные белки ФПФаз 30
2.9. Роль пирофосфатсодержащих соединений, фторида и ионов двухвалентных металлов в регуляции активности ФПФаз 33
2.10. Влияние гормонов на уровень ФПФазной активности 35
2.11. Регуляция ФПФаз глутатионом и полиаминами 37
2.12. Механизм действия фосфата з 38
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
3.1. Выделение клеточных ядер из селезенки быка 44
3.2. Экстракция из ядер и очистка ФПФазы 44
3.3. Определение активности и Е^ ФПФазы 45
3.4. Электрофоретическое разделение белков 46
3.5. Идентификация ядерной ФПФазы методом двойных флуоресцирующих антител 47
3.6. Определение молекулярной массы ФПФазы .'. 48
3.6.1. Определение молекулярной массы ФПФазы методом гель-хроматографии на сефадексе
3.6.2. Определение молекулярной массы ФПФазы
электрофорезом в ПААГ в нативных условиях 49
3.7. Определение аминокислотного состава ФПФазы. 50
3.8. Количественное определение свободных сульфгид-рильных групп и дисульфидных мостиков 51
3.9. Изучение спектра поглощения ФПФазы в видимой области 52
3.10. Иммобилизация ФПФазы 52
З.П. Изучение влияния температуры и рН на активность растворимой и иммобилизованной ФПФазы 52
3.12. Влияние ингибиторов на активность ФПФазы 53
3.13. Влияние модификаторов аминокислот на активность ФПФазы 54
3.I3.I. Влияние модификаторов сульфгидрильных групп на активность ФПФазы 54
3.13.2. Влияние ТНБС на активность ФПФазы . 55
3.13.3. Влияние ДЭПК на активность ФПФазы . 56
3.14. Изучение трансфосфорилирования в присутствии ФПФазы 56
3.15. 180-обмен в системе с ФПФазой 57
3.15.1. Постановка опытов хо0-обмена 57
3.15.2. Выделение и очистка Ф„ и НФ для анализа на содержание хо0. 57
3.15.3. Подготовка образцов Фн и НФ к масс-спектрометрическому анализу . 58
3.15.4. Анализ изотопного состава кислорода в С02 59
3.15.5. Расчеты содержания 180 в образцах 59
3.16. Выделение комплекса 35Р-ФПФаза 60
3.17. Определение концентрации белка 61
3.18. Определение содержания углеводов в составе ФПФазы 61
3.19. Статистическая обработка экспериментальных данных 62
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 63
4.1. Выделение и очистка ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 63
4.2. Субстратная специфичность и к^ ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 70
4.3. Молекулярная масса ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 74
4.4. Химический состав и спектр поглощения ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 77
4.5. Иммобилизация ФПФазы из ядер селезенки быка и сравнительная характеристика иммобилизованной и растворимой форм фермента 83
4.6. Ингибиторы ФПФазы ядер селезенки быка 89
4.7. Влияние модификаторов аминокислотных остатков
на активность ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 98
4.8. Механизм действия ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 102
4.8.1. 180-обмен в ходе гидролиза АДФ и пНФФ ФПФазой из ядер селезенки быка
4.8.2. Трансфосфорилирование в присутствии ядерной ФПФазы из селезенки быка 106
4.8.3. Выделение фосфорилированного фермента после преинкубации ядерной ФПФазы с
меченым субстратом
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ . 125
7. ЛИТЕРАТУРА ' 128
- Локализация ФПФаз
- Выделение клеточных ядер из селезенки быка
- Выделение и очистка ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка
Локализация фосфопротеинфосфатаза
ФПФазы широко распространены в различных тканях животных. Они выявлены в печени, почке, селезенке, жировой ткани, эритроцитах (105), нервной ткани (15, 175), сердце (94), коре надпочечников (120), скелетной (24) и гладкой (129) мышце, матке (140), ретикулоцитах (124) и в других тканях млекопитающих, в икре лягушек (72), в спермиях морского ежа (155), в дрожжах (174), в гепатоме Новикова (127), T0RC-2 клетках (156). Кроме того, ФПФазная активность обнаружена в различных клеточных структурах: цитозоле (105), плазматической (109) и ядерной (149) мембранах, митохондриях (42), ядре (121, 122), ядрышке (127), хроматине (48). Таким образом, ФПФазы присутствуют во многих, если не во всех, тканях животных. Это обстоятельство свидетельствует о важной роли ФПФаз в регуляции фосфорилирования белков, а в конечном итоге - в регуляции многих биологических процессов.
2.2. Субстратная специфичность ФПФаз
ФПФазы катализируют дефосфорилирование различных фосфори-лированных белков. Субстратами этих ферментов являются более двадцати энзимов, вовлеченных в метаболизм углеводов, липидов, аминокислот, белков, нуклеиновых кислот (86, ПО). ФПФазы де-фосфорилируют белки цитоплазмы (42), мембран эритроцитов (141), ядерных мембран (149), негистоновые белки хроматина и гистоны (157), белки ядрышка (127), рибосом (130), фосвитин, казеин (142), фосфопептиды (162) и многие другие фосфопротеины.
ФПФазы катализируют дефосфорилирование белков, фосфорили - 12 -рованных как по остатку серина и треонина (86), так и по остатку тирозина (53, 54). ФПФаза из печени и мышцы кролика, сердца быка катализирует де тиофо с формирование - -тиофосфо-ршщрованной фосфорилазы (158), Скорость детиофосфорилирования составляет одну треть от скорости дефосфорилирования фосфорилазы.
Кроме того, выделен белок (Mr = 66000 Д), гомогенность которого показана электрофорезом в присутствии ДСН, одновременно обладающий ФПФазной и протеинкиназной активностями (112).
Значительная часть ФПФаз не дефосфорилирует низкомолекулярные фосфорные эфиры, такие как АТФ И ПНФФ (39, 65, 97, ИЗ, Пб). Другая группа ФПФаз катализирует дефосфорилирование наряду с фосфопротеинами и низкомолекулярных фосфорных эфиров (122, 140, 141).
ФПФазы являются, как правило, неспецифическими ферментами, способными дефосфорилировать различные фосфопротеины (86). Целый ряд ФПФаз дефосфорилирует как основные, так и кислые фосфорилированные белки (39, 94. 97, ИЗ). Гратекос и сотр. (65) выделили фосфорилазофосфатазу из мышц кролика, которая дефосфорилирует фосфорилазу, тропонин, но не активна по отношению к кислым фосфопротеинам (казеин, фосвитин). С другой стороны, ФПФаза из селезенки человека катализирует дефосфорилирование фосфоказеина и фосвитина и практически не дефосфорилирует гистоны, киназу фосфорилазы и гликогенсинтазу (142). Относительно высокой субстратной специфичностью обладает Са-кальмодулин-зависимая ФПФаза, которая в существенной степени дефосфорилирует только три из двадцати исследованных субстратов: сС-субъединицу киназы фосфорилазы, термостабильный ингибитор ФПФазы и легкую цепь миозина (86).
Выделение клеточных ядер из селезенки быка
Селезенку получали на мясокомбинате сразу после убоя животного, замораживали и хранили при -20С. Перед выделением ядер селезенку размораживали. Клеточные ядра выделяли при 4С. После размораживания селезенку измельчали в мясорубке, затем в микроизмельчителе тканей PT-I в течение 3 мин при 8000 об/мин в 50 Mil трис-НСІ буфере, рН 7,55, содержащем 0,25 М сахарозы, 25 мМ КСІ, 10 мМ Mg0l2« Соотношение ткани и раствора было 1:4. Гомогенат пропускали через сито, затем фильтровали через капроновый фильтр (размер пор 90 х 200 мкм) и центрифугировали при 800 g в течение 7 мин на центрифуге К-70. Растворимые ци-топлазматические компоненты удаляли повторными промывками того же раствора. Затем осадок ядер промывали растворами (соотношение осадка ядер и раствора было 1:10) 3 мМ CaCL? в 10 іМ трис-НСІ буфере, рН 7,55, для лизиса эритроцитов и 0,2 М НаСі для удаления растворимых ядерных белков. Для облегчения экстракции ФПФазы на следующем этапе осадок ядер обрабатывали безионным раствором 0,25 М сахарозы.
Осадок ядер гомогенизировали в растворе 0,4 М буфера А в микроизмельчителе тканей РТ-І в течение 15 мин при 8000 об/мин; соотношение осадка ядер и раствора - 1:5. Гомогенат оставляли .на ночь при 4С. Затем центрифугировали в течение 30 мин при 2500 g. Для полного выделения фермента экстракция повторялась несколько раз. Экстракт разводили водой до конечной концентра - 45 -ции буфера А 0,3 М. К разведенному экстракту добавляли фосфо-целлюлозу, тщательно перемешивали в течение 30 мин на магнитной мешалке. После отстаивания надосадочную жидкость сливали, шосфоцеллюлозу промывали 0,3 М буфером А и помещали в хромато-графическую колонку (4 х 17 см). Колонку промывали 0,3 М буфером А. ФПФазу элюировали I М буфером А. После элюции препарат фермента диализовали против дистиллированной воды до конечной концентрации буфера А 0,3 М.- Затем проводили повторную хроматографию ФПФазы на фосфоцеллюлозной колонке (1,7 х 25 см). Условия сорбции, отмывки колонки от несвязавшегося материала и элюции фермента аналогичны первой хроматографии на фосфоцеллю-лозе. Далее препарат ФПФазы в I М буфере А фракционировали на колонке с сефадексом G-75 (3,5 х 80 см), уравновешенной 0,3 М буфером А. Затем ФПФазу очищали методом аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе. ФПФазу наносили на колонку (1,5x4 им), содержащую конканавалин-А-сефарозу в 0,3 М буфере А, промывали этим же буфером и элюировали 0,5 М об-метил-Д-манно-зидом в 0,3 М буфере А. Очищенный фермент хранили в запаянных ампулах при -20С.
Выделение и очистка фосфопротеинфосфатаза из клеточных ядер селезенки быка
В предварительных экспериментах исследовали условия экстракции ФПФазы из ядер селезенки быка растворами 0,2 - 1,0 М буфера А и раствором 0,2 М буфера А с добавлением хлористого натрия. Наиболее удачным оказался 0,4- М буфер А, который извлекает полностью фермент с минимумом дополнительных белков. Растворы с концентрацией буфера А до 0,4- М оказались практически не эффективными для экстракции фермента. Растворы с концентрацией буфера А более 0,4- М увеличивают выход белков, не обладающих ФПФазной активностью. Использование хлористого натрия для увеличения ионной силы не желательно, так как он является ингибитором ФПФазы.
После экстракции ФПФазу очищали последовательно методами ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе, гель-фильтрации на сефадексе G-75, аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе.
В предварительных опытах были подобраны условия сорбции и десорбции ФПФазы на фосфоцеллюлозе. Было установлено, что большая часть белков ядерного экстракта не сорбируется на фосфоцеллюлозе при концентрации буфера А 0,3 М, тогда как ФПФаза сорбируется почти полностью (около 90$). Десорбция ФПФазы с фосфоцеллюлозы происходит при концентрации буфера А более 0,5 М. В данной работе был использован I М раствор буфера А. , для того, чтобы ускорить процесс десорбции и уменьшить объем элюции.
На следующей стадии очистки ФПФазы методом гель-хроматографии на сефадексе G-75 удается дополнительно очистить фермент от белков, которые нельзя удалить на последнем этапе очистки на конканавалин-А-сефарозе.
Заключительным этапом очистки ФПФазы является аффинная хроматография на конканавалин-А-сефарозе. Сорбцию фермента на конканавалин-А-сефарозе проводили в 0,3 М буфере А. В этих условиях ФПФаза полностью связывается с аффинным сорбентом, в то время как другие белки не взаимодействуют с последним. ФПФазу с конканавалин-А-сефарозы элюировали 0,5 М с-метил-Д-маннозидом.
Данный метод позволяет получить из 3 кг ткани I-I4 мг вы-сокоочищенного препарата ФПФазы. Различия в количестве выделяемого фермента связаны с колебаниями исходного содержания ФПФазы в селезенке.
Результаты одного из четырех аналогичных опытов по выделению ФПФазы из ядер селезенки быка представлены в таблице 3 и на рис. 1-4.
В результате первой стадии очистки ФПФазы на фосфоцеллю-лозе фермент был очищен в 23 раза. Этот этап позволил освободиться от 98% примесных белков (таблица 3, рис. I).
Для кон центрирования препарата ФПФазы и увеличения степени очистки была проведена повторная хроматография на фосфоцел-люлозе. После рехроматографии препарат фермента был значительно сконцентрирован и дополнительно очищен в 3 раза (таблица 3, рис. 2). Следует отметить, что в процессе очистки ФПФазы на фосфоцеллюлозе теряется около 70% активности фермента (табл.3).
