Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1. Структура и химические свойства фолатов 7
1.1.1. Строение и номенклатура фолатов 7
1.1.2. Физико-химические и химические свойства фолатов 10
1.1.3. Химические синтезы коферментных форм фолиевой кислоты .26
1.2. Фотохимические свойства фолатов 27
1.2.1. Спектральные характеристики фолатов 27
1.2.2. Пути передачи энергии возбуждения птеринами и фолатами 33
1.2.3. Фотовосстановление птеринов 35
1.2.4. Активируемые светом реакции восстановления аналогов фолиевой кислоты с участием дигидрофолатредуктазы 36
1.2.5. Фотодеструкция фолиевой кислоты и ее производных 37
1.2.6. Антирадикальные и антиоксидантные свойства фолатов 39
1.3. Биологические и фотобиологические функции фолатов 42
1.3.1. Метаболизм фолатов 42
1.3.2. Фотобиологические функции фолатов 50
1.4. Заключение и постановка задачи 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы 59
2.1. Материалы 59
2.1.1. Реактивы 59
2.1.2. Получение производных фолиевой кислоты для ВЭЖХ— анализа . 59
2.2. Методы 60
2.2.1. Установки для УФ-облучения образцов 60
2.2.2. Проведение экспериментов 60
2.2.3. ЭПР-анализ 62
2.2.4. Хроматографический анализ продуктов реакции 63
2.2.5. Определение п-аминобензоил-Ь-глутаминовой кислоты 64
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 66
3.1. Фотовосстановление фолиевой кислоты 67
3.1.1 .Влияние доноров электрона на фотовосстановление фолиевой кислоты 67
3.1.2. Формилирование как метод идентификации тетрагидрофолиевои кислоты в продуктах фотовосстановления 74
3.1.3. Участие свободных радикалов в фотовосстановлении фолиевой кислоты 78
3.2. Исследование влияния УФ-облучения на трансформацию одноуглеродных производных фолатов 80
3.2.1. Формилирование тетрагидрофолиевои кислоты с образованием метенилтетрагидрофолиевой кислоты 81
3.2.2. Превращение 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в 5-формилтетрагидрофолиевую кислоту 81
3.3. Восстановленные фолаты как объекты деградирующего воздействия ультрафиолета. Роль кислорода 84
3.3.1. Фотодеградация дигидрофолиевой, тетрагидрофолиевои и 5-формилтетрагидрофолиевой кислот 85
3.3.2. Фотоустойчивость 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты 87
3.4. Коферментные производные фолиевой кислоты в эволюции биологических рецепторов света 94
3.5. Фотохимические реакции фолатов как элемент новой технологии получения кальция фолината 97
Выводы 101
Приложение 102
Список литературы 112
- Строение и номенклатура фолатов
- Активируемые светом реакции восстановления аналогов фолиевой кислоты с участием дигидрофолатредуктазы
- Получение производных фолиевой кислоты для ВЭЖХ— анализа
- .Влияние доноров электрона на фотовосстановление фолиевой кислоты
Введение к работе
Фолиевая кислота (ФК, птероил-Ь-глутаминовая кислота, витамин Вс или В9) составляет структурную основу коферментов, обязательных участников переноса и трансформации одноуглеродных (метильных и формильных) групп в биосинтезе нуклеотидов и аминокислот. С учетом неспособности организма человека синтезировать птеридиновый гетероцикл, фолиевая кислота, а в последнее время также некоторые её коферментные производные, например, фолиновая кислота (5-формил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота, 5-формил-ТГФК), используются в качестве витаминных препаратов. Обладающие цитостатическим действием антиметаболиты фолатов (метотрексат и др.) широко применяют в терапии онкозаболеваний [Андреева и др., 1982, Calabro and Stember, 2007].
Характеристика фотохимических свойств фолатов представляет интерес для ряда областей фотобиологии и фотомедицины, например, для формирования представлений о молекулярных мишенях воздействия УФ-излучения на организм. Вместе с тем, информация относительно этих свойств фолатов, как и других биологических птеринов, до последнего времени носила фрагментарный характер.
Таким образом, возникла необходимость исследования фотохимических свойств ФК, в частности, способности ее фотовосстановления, поскольку все фолатные коферменты являются производными 5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФК). Можно было ожидать, что результаты такого исследования будут полезны для совершенствования технологий синтеза лекарств на основе фолатов.
Еще одно обстоятельство, определяющее интерес к фолатам как объектам фотобиохимического исследования, это участие одного из коферментов - 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (5,10-метенил-ТГФК) в физиологической рецепции света. Проблема рецепции ближнего УФ и синего света живыми организмами является одной из актуальных проблем современной биохимии.
Ближний УФ и синий свет являются мощными регуляторами многих жизненно важных процессов таких, как репарация УФ и радиоповреждений генетического материала, инициирование биосинтеза каротиноидов, меланинов и других веществ, защищающих клетки от фото- и радиоповреждений, фоторегуляция ферментативной активности ряда ферментов, а также процессов фоторегенерации тканей, фотоморфогенеза, фотосинтеза и т. д.
5,10-Метенил-ТГФК входит в состав ДНК-фотолиаз - ферментов, катализирующих фоторепарацию поврежденной ультрафиолетом ДНК. Кроме того, данное соединение обнаружено в качестве хромофора белков одного из семейств рецепторов синего света - криптохромов. Эти фоторецепторы участвуют в регуляции светозависимых процессов онтогенеза у растений, а также, по-видимому, осуществляют контроль над проявлением циркадных ритмов у высших эукариот. В составе белков - рецепторов света фотовозбужденная 5,10-метенил-ТГФК непосредственно не вступает в химические реакции, а функционирует как светосборщик, энергия возбуждения которого передается на молекулу флавина, выполняющего в активном центре роль редокс-агента [Sancar, 2003]. Важным условием осуществления такой «антенной» функции является химическая стабильность молекулы при воздействии на нее света. Несмотря на то, что данное свойство молекулы могло иметь серьезное значение для эволюционного отбора, ранее не предпринималось попыток исследовать фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК и сопоставить ее с фотоустойчивостью других фолатных коферментов.
Таким образом, по своей проблематике диссертационное исследование ориентировано на решение ряда актуальных задач биохимии. Среди этих задач - исследование свойств фотовозбужденных молекул фолатных коферментов, которые могут функционировать как низкомолекулярные биорегуляторы, а также формирование представлений о химических основах биологической рецепции света и воздействии на организм ультрафиолетового излучения.
Строение и номенклатура фолатов
Фолатами называют различные производные фолиевой кислоты, в состав которой входят птеридиновая гетероциклическая структура (состоящая из пиримидинового и пиразинового колец), п-аминобензойная кислота и один или несколько остатков глутаминовой кислоты. Систематическое название фолиевой кислоты согласно номенклатуре IUPAC (28)-2-[4-[[(2-амино-4(ЗН)-оксоптеридин-6-ил)метил]амино]бензамидо]пентандиоевая кислота. 2-Амино-4(ЗН)-оксоптеридины, которые являются основой большинства природных птеридинов, имеют тривиальное название «птерины», в связи с чем фолаты также еще называют конъюгированными птеринами. Соответственно, неконъюгированными птеринами называют соединения, содержащие птериновое кольцо с различными небольшими по массе и объему заместителями. Примерами природных неконъюгированных птеринов могут быть: биоптерин, неоптерин, ксантоптерин и т.д.
Природные производные ФК - это обычно ди- или тетра-восстановленные формы, которые могут иметь заместители по 5 и 10 атомам азота, и содержать несколько остатков глутаминовой кислоты, которые присоединяются посредством образования пептидных связей через гамма-карбоксильные группы. Известны следующие производные ФК: 5,6-, 6,7-, 5,8- или 7,8 дигидрофолиевая кислота (ДГФК), 5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК), 5-метил-ТГФК, 5-формил-ТГФК (фолиновая кислота), 5-оксиметил-ТГФК, 5-формимино-ТГФК, 10-формил-ТГФК и циклические 5,10-метилен-ТГФК и 5,10-метенил-ТГФК.
Тетрагидрофолаты имеют два асимметрических центра: один, как и у всех производных ФК - это Ц+)-глутаминовая кислота ([ос]" +19.9), второй находится в 6 положении птеринового кольца. Существуют, как природные, биологически активные изомеры тетрагидрофолатов, так и биологически неактивные формы [Baggott et al., 2001, Baggott and Tamura, 1999, Рое and Benkovic, 1980, Temple and Montgomery, 1984].
Неприродные изомеры фолатов не активны в ферментативных реакциях.и не поддерживают рост фолат-зависимых бактерий, используемых для микробиологической идентификации фолатов. Например, неприродная [6S]-10-формил-ТГФК является также ингибитором фосфорибозилглицинамид-формилтрансферазы (КФ 2.1.2.2) [Рое and Benkovic, 1980]. Природные и неприродные изомеры фолатов приведены в таблице 1. формил-ТГФК 6R 6S Долгое время считалось, что человек не может утилизировать производные 5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты с неприродной конформацией у 6-го углеродного атома, поскольку эти фолаты энзиматически и микробиологически неактивны.
Baggott и Tamura [Baggott and Tamura, 1999] выдвинули гипотезу, по которой при оральном введении неприродные [6ІІ]-5-формил-іТФК и [6S]-5,10-метенил-ТГФК являются биоактивными для человека, поскольку могут неферментативным путем окисляться до 10-формил-7,8-дигидрофолата, который не является оптически активным по 6 положению соединением и далее может возвратиться в активный пул фолатов в виде природной [68]-ТГФК. Это происходит следующим образом: сначала из [6К]-5-формил-ТГФК образуется [68]-5Д0-метенил-ТГФК. Эта реакция может протекать в кислой среде желудка. Затем [68]-5,10-метенил-ТГФК может переходить в [68]-10-формил-ТГФК в слабощелочной среде тонкого кишечника. Последующее окисление [6SJ-10-формил-ТГФК может протекать с участием молекул цитохрома с, что экспериментально подтверждено авторами. Продуктом этого окисления является 10-формил-7,8-дигидрофолат [Baggott et al., 2001].
Далее 10-формил-7,8-дигидрофолат деформилируется в ДГФК с помощью фермента фосфорибозиламиноимидазолкарбоксамидформил-трансферазы (КФ 2.1.2.3) Затем под действием дигидрофолатредуктазы ДГФК превращается в [68]-ТГФК. В ходе различных метаболических реакций [6S]-ТГФК может переходить в биоактивную [68]-5-метил-ТГФК, основной фолат, который накапливается в плазме крови в ходе обмена фолатов (рис. 7).
Гипотезу авторов подтверждают полученные Baggott с сотрудниками [Baggott et al., 2001] экспериментальные данные по измерению концентрации фолатов в плазме и моче человека после введения оральных доз [6Я]-5-формил-ТГФК. По этим данным была сделана оценка их активности, которая составила от 14 до 50% по сравнению с активностью [68]-5-формил-ТГФК. Большая часть фолатов в плазме и моче была в виде [68]-5-метил-ТГФК. Таким образом, можно считать, что использование рацемической смеси лекарственного препарата [68К]-5-формил-ТГФК в оральной форме может быть целесообразным, так как в организме человека в значительной степени будет утилизироваться и неприродный С6-изомер этого соединения.
Активируемые светом реакции восстановления аналогов фолиевой кислоты с участием дигидрофолатредуктазы
Сведения о фотохимических реакциях птеринов в комплексе с белками малочисленны. Было проведено исследование [Ledbetter et al., 1995] рекомбинантнои дигидрофолатредуктазы человека, которая содержит в качестве кофактора НАДФ-Н и в качестве субстрата L-биоптерин, вместо фолата. Под действием света L-биоптерин переходит в возбужденное триплетное состояние и далее взаимодействует с НАДФ-Н, забирает Н , с образованием радикала L-биоптерина. В возбужденном состоянии L-биоптерин может находиться в двух конформационных формах лактамной и лактимной, что подтверждается наличием двойной фосфоресценции. Лактамные и лактимные таутомеры реагируют с НАДФ-Н с разной скоростью: в фотоиндуцированной реакции лактимная форма в 8 раз более активна. Фотовосстановление биоптерина может протекать и в отсутствие фермента, но со значительно меньшей скоростью, поскольку для эффективного переноса электрона и водорода необходимо, чтобы возбужденный птерин и донор находились на достаточно близком расстоянии. В дигидрофолатредуктазе они находятся на расстоянии 3,5 А.
В то же время известно, что в темновой редуктазной реакции принимает участие лактамный таутомер фолата. Вероятно, активирующее действие света на светозависимые процессы с участием птеридинов в качестве кофакторов или субстратов можно связать с переходом птеридинов в более активную при действии света лактимную форму [Ledbetter et al., 1995]. Аналогичный процесс может иметь место в сетчатке глаза, где присутствуют L-биоптерин и редуктаза, и отмечается повышенное содержание тетрагидробиоптерина при действии света [Cremer-Bartelset al., 1992]. Недавно показано, что в активном центре дигидрофолатредуктазы фотовозбужденный метотрексат (антиметаболит ФК) реагирует с НАДФ-Н с образованием 5,8-дигидрометотрексата и НАДФ+ [Chen et al., 1999].
Для возбужденных молекул фолатов имеются некоторые отличия от темновых процессов окисления и восстановления, поэтому рассмотрим более подробно процессы фоторазложения фолатов в присутствии и в отсутствие кислорода воздуха и в присутствии белков.
В водных растворах, в присутствии кислорода ФК может разрушаться под действием УФА излучения (А. 320 -г 400 нм) с образованием ПАБГ и 6-формилптерина (рис. 5), который в свою очередь окисляется до 6-карбоксиптерина [Hirakawa et al., 2003, Lorente and Thomas, 2006, Lowry et al., 1949, Off et al., 2005, Thomas et al., 2000, Thomas et al., 1998]. Квантовый выход данной реакции составляет 2,9x10" [Lorente and Thomas, 2006]. В кислых растворах (рН 2- -4, нейтральная молекула) скорость фотолиза наиболее высокая (максимальная скорость при рН 2,5, константа скорости реакции k = 5,04x10" мин" ), в нейтральных (рН 5- -7, моно- и дианион) средняя и наиболее низкая (к = 0,15x10" мин" ) в щелочных (рН 8- -10, трианион) [Akhtar et al., 1999, Lowry et al., 1949]. В щелочных условиях (рН 10 -11) наряду с процессом фоторазложения идет еще один процесс (с квантовым выходом 2,2x10"3) с образованием продуктов фотоокисления с молекулярной массой, близкой к массе ФК (продукты А и В на рис. 5) [Thomas et al., 2002].
Фоторазложение ФК в присутствии кислорода идет в три фазы: первая -медленная фаза накопления продуктов фоторазложения (6-формилптерина и ПАБГ). Вторая - быстрая, связана с фотосенсибилизирующим действием продуктов разложения, поскольку птерины, при освещении УФ светом способны генерировать синглетный кислород, который в свою очередь может способствовать разложению ФК (константа тушения синглетного кислорода 11 3,0x10 М" с" ). И третья, где уже идет фотоокисление 6-формилптерина до 6-карбоксиптерина [Lorente and Thomas, 2006, Off et al., 2005, Vorobey et al., 2006]. Свет также ускоряет процессы окисления ТГФК и 5-метил-ТГФК и способствует их разрушению, что может быть причиной сезонного (летнего) замедления роста раковых опухолей, поскольку идет частичное снижение уровня фолатов у больных людей [Kallen, 1971, Steindal et al., 2007]. Хотя для здоровых людей было показано, что солнечный свет не оказывает влияния на содержание фолатов в крови [Gambichler et al., 2001].
В отсутствие кислорода, при действии УФА-излучения фотодеградация ФК практически не идет, как в кислых, так и в щелочных условиях [Lorente and Thomas, 2006, Lowry et al, 1949, Thomas et al., 2000, Thomas et al., 1998]. И только в достаточно жестких условиях восстановительного кислотного гидролиза ФК с H2SO3 свет ускорял образование 6-формилдигидроптерина. В данном случае параллельно с расщеплением C9-N10 связи шло восстановление птеринового кольца; аналогичные реакции были показаны для биоптерина, неоптерина и 6-формилптерина в анаэробных условиях, где окисление заместителя в С6 положении сопровождалось восстановлением птериновой части за счет внутримолекулярного переноса водорода [Blair, 1957, Lorente and Thomas, 2006, Thomas et al., 2001, Waller et al., 1950].
В присутствии белков ФК становится более устойчивой к воздействию УФА света даже в аэробных условиях. Здесь главную защитную роль играет аминокислота - триптофан, которая в основном разрушается в процессе облучения, поскольку она является конкурентным тушителем синглетного кислорода (константа тушения 3,2x10 М" с" ). Синглетный кислород образуется за счет фотосенсибилизации продуктами фоторазложения ФК (6-формилптерином и 6-карбоксиптерином) и является причиной дальнейшего разрушения ФК [Vorobey et al., 2006]. Защитная функция белков показана также при фоторазложении метотрексата [Chahidi et al., 1983].
Получение производных фолиевой кислоты для ВЭЖХ— анализа
В работе использовали следующие реактивы: фолиевая кислота (98 %), дигидрофолиевая кислота (80 %), тетрагидрофолиевая кислота (70 %), фолинат кальция (99 %), боргидрид натрия (98 %) - «Sigma Aldrich Со» (США), L-цистеин гидрохлорид, п-аминобензоилглутаминовая кислота, натрий азотистокислый, К-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорид фирмы «РЕАХИМ» (Россия). Для предотвращения процессов разложения при работе с восстановленными птеринами использовали 0,01 М 2-меркаптоэтанол фирмы «Ferak» (Германия), 0,0002 М, унитиол фирмы «Ферейн» (Россия), 0,005 М дитиотрейтол фирмы «LOBA» (Австрия). Все растворы готовились на деионизованной воде. 2.1.2. Получение производных фолиевой кислоты для ВЭЖХ - анализа. 10-формилфолиевую кислоту синтезировали формилированием ФК [Scott, 1980]. Для этого, ФК растворяли в концентрированной муравьиной кислоте и выдерживали 24 ч в темноте. Муравьиную кислоту удаляли с помощью лиофильной сушки и получали 96 % 10-формилфолиевую кислоту (по данным ВЭЖХ). 10-формилтетрагидрофолиевая кислота была нами получена гидролизом 5,10-метенил-ТГФК при рН 8,0 в присутствии меркаптоэтанола [Scott, 1980, Baggott et al., 1995]. 10-формилдигидрофолиевая кислота получена при неполном окислении на воздухе 5,10-метенил-ТГФК при рН 8,0 [Scott, 1980, Baggott et al, 1995]. 5,10-метенилтетрагидрофолиевую и 5-формилтетрагидрофолиевую кислоты получали методом, описанным в Приложении
Источником излучения служили осветитель ОЙ-18 с ртутной лампой среднего давления ДРК 120 или ртутная лампа ДРЛ-400, из спектра которых светофильтром УФС-6 выделяли область 310 -г 390 нм (X 350 ± 40 нм), либо светофильтром УФС-5 область 280 - 390 нм. Облучение также проводили в установке, состоящей из спектрофотометра СФ 2000 фирмы «Спектр», (Россия) и источника возбуждающего света - ксеноновой лампы ДКсШ-150 с монохроматором. Во всех экспериментах ширина щели монохроматора была равна 40 нм. В опытах по фотовосстановлению и фотодеструкции восстановленных фолатов интенсивность облучения, падающего на образец (энергетическая освещенность), была одинаковой и составляла 0,4 ± 0,2 Вт-м" . В некоторых опытах по фотодеструкции 5,10-метенил-ТГФК интенсивность света составляла 20 Вт-м" (ртутная лампа ДРЛ-400). Энергетическую освещенность измеряли радиометром «Аргус 04» (ФГУП «ВНИИОФИ», Россия).
Облучение образцов проводили в герметичных кварцевых кюветах (оптический путь 1 см), помещенных в охлаждаемый протоком воды кюветодержатель. Для удаления кислорода кювету продували в течение 10 мин. током аргона или азота, либо откачивали воздух вакуумным насосом в течение 10 мин. В качестве контролей использовали растворы без фолиевой кислоты, а также системы, содержащие все компоненты без облучения.
Фотовосстановление ФК (5х10"5М или Ю М) проводили в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) в анаэробных условиях, создаваемых продувкой аргоном или вакуумированием. Концентрация (5x10" М или 10" М) донора электрона (ЭДТА, НАД-Н, боргидрид натрия) на два порядка превышала концентрацию ФК. Контролями служили растворы без ФК, а также системы, содержащие все компоненты реакционной смеси, но не подвергнутые облучению. Для формилирования полученной ТГФК с образованием 5,10-метенил-ТГФК после облучения к раствору добавляли 99,7 % муравьиную кислоту (НСООН) до её концентрации 50 % и оставляли в темноте под аргоном на ночь. В некоторых экспериментах фотовосстановление проводили сразу в присутствии муравьиной кислоты (10 - 30 %) для сопряженного формилирования ТГФК и получения 5,10-метенил-ТГФК.
Для изучения влияния УФ-излучения (ксеноновая лампа, К 300 ± 20 нм) на процесс формилирования брали ЗхЮ"5 М ТГФК в 5 или 50 % муравьиной кислоте с добавлением антиоксиданта дитиотрейтола (5x10" М).
Изучение фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК к УФА-свету (X 350 ± 40 нм), проводили в 0,05 М калий-фосфатном буфере или в 0,002 М НС1 или в растворах муравьиной кислоты различной молярности с доведением рН до 2,7 во всех случаях. Для изучения фотоустойчивости восстановленных форм фолиевой кислоты 5x10"5 М растворы ТГФК или ДГФК в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 2,7 и 7,0 облучали в области максимумов поглощения.
Влияние УФА света (А, 350 ± 40 нм) на процесс превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК изучали в растворе 5x10"5 М 5,10-метенил-ТГФК в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 4,5.
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре «Hitachi 557» (Япония) или спектрофотометре СФ 2000 фирмы "Спектр" (Россия). Спектры флуоресценции исследовали на спектрофлуориметрах: «Hitachi 3000» и «Hitachi MPF-4» фирмы Hitachi (Япония), а также на спектрофлуориметре DU-650 фирмы "Shimadzu" (Япония). Спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции в двухмерном представлении, а также флуориметрический анализ продуктов разделения методом ВЭЖХ проводили на спектрофлуориметре «Флюорат-02-Панорама» фирмы «Люмэкс» (Россия).
.Влияние доноров электрона на фотовосстановление фолиевой кислоты
Фотовосстановление ФК исследовали в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), деаэрированном продувкой аргоном или вакуумированием. При облучении УФ-светом (X 350 ± 40 нм) в течение одного часа раствора ФК (5x10" М), содержавшего ЭДТА (5x10" М), который широко используется как донор при исследовании фотохимии флавинов и птеринов [Heelis, 1982], происходило выцветание полосы поглощения ФК с максимумом в области 350 нм и увеличивалось поглощение в области 280 + 320 нм, соответствующее поглощению восстановленных форм ФК (рис. 11). Эти изменения особенно наглядны в разностном спектре «свет минус темнота» (рис. 11, вставка). Такой Х,нм Рис. 11. Изменение спектра поглощения реакционной смеси 5x10"5 М ФК, 5х10_3 М ЭДТА в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7 при облучении УФ-светом (X 350 ± 40 нм) в условиях деаэрации. На вставке: разностный спектр поглощения "свет минус темнота". характер изменения спектра поглощения указывал на образование ДГФК. Положение изобестической точки при 325 нм соответствовало превращению ФК в ДГФК. Константа начальной скорости (к) восстановления ФК в этих условиях составляла 0,010 ± 0,005 мин"1. Без облучения изменений в спектре ФК не наблюдалось.
На фотовосстановление ФК указывало также появление характерной для ДГФК флуоресценции в области 425 нм (А 03б = 315 нм). ДГФК была идентифицирована в продуктах фотохимической реакции с помощью ВЭЖХ (рис. 12). Согласно результатам этого анализа, после одного часа облучения ее ДГФК зо 50 время удерживания, мин. ВЭЖХ хроматограммы продуктов фотовосстановления ФК, детектирование при X 300 нм. А - без облучения, Б - после облучения УФ-светом (к 350 ± 40 нм) в течение одного часа. выход (в расчете на моль исходной ФК) составил 5 ± 2%.
При более продолжительном облучении длинноволновая полоса поглощения ФК полностью исчезала (рис. 11). Наряду с этим в течение второго часа облучения. снижалась интенсивность коротковолнового максимума поглощения, и он сдвигался в сторону 270 нм (270 нм - максимум поглощения ПАБГ). Это указывало на то, что параллельно с восстановлением ФК происходило разложение фолатов. Процесс фоторазложения ФК в первую очередь затрагивает самую лабильную C9-N10 связь, и при ее разрыве образуются п-аминобензоилглутаминовая кислота и различные птерины, которые могут содержать в шестом положении метильную, оксиметильную, альдегидную или карбоксильную группу. Степень окисления заместителя в С6 положении образующегося птерина, по-видимому, коррелирует с количеством кислорода, присутствующего в облучаемой системе и который невозможно убрать полностью из системы даже вакуумированием. Здесь следует отметить, что птерины являются активными фотосенсибилизаторами и могут продуцировать активные формы кислорода (синглетный кислород и др. [Неверов и др., 1996]), которые окисляют различные субстраты и следовательно легко могут далее окислять отщепившиеся птерины. Более того, получающаяся в процессе восстановления дигидроформа ФК содержит восстановленную птериновую структуру, которая также может быть фотосенсибилизатором, и её фотовозбуждение может приводить к образованию активных форм кислорода. Дигидрофолиевая кислота в фотопроцессах также может разлагаться, давая продукты, поглощающие в области 420 нм, которые мы наблюдали при длительном облучении исследуемых систем [Zakrzewski and Sansone, 1971]. Определение содержания ПАБГ в продуктах реакции показало, что после двух часов облучения 28 ± 2 % молекул исходной ФК разрушалось с образованием ПАБГ.
Облучение растворов ФК в диапазоне 280 -г 390 нм, т.е. в области, захватывающей коротковолновый максимум поглощения ФК (А, 280 нм), отличающийся высоким значением молярного коэффициента экстинкции (ємакс = 27000 моль"1 -см"1 вместо 7000 моль"1 -см"1 при 350 нм) приводило к тому, что уже после 40 мин облучения количество молекул ФК, разложившихся с образованием ПАБГ (более 40 %), в полтора раза превышало их количество при облучении светом X 350 ± 40 нм. Образование ДГФК при этом не увеличилось. Следовательно, возбуждение ФК в коротковолновом максимуме (Л,тах 280 нм) ускоряет деградацию фолатов.
Помимо ЭДТА (Е0 = +0,40 В), в качестве доноров электрона для фотовосстановления ФК исследовали соединения с более отрицательными значениями электродного потенциала: НАД-Н (Е0 = -0,32 В) и боргидрид натрия (Е0 = -0,48 В или -1,24 В, в зависимости от условий проведения реакции восстановления). НАД-Н является природным донором электрона и протона в реакциях темнового ферментативного восстановления ФК и ДГФК. В его присутствии возбуждение УФ-областью 310 + 390 нм индуцировало в растворах ФК спектральные изменения, указывающие на присутствие ДГФК и ТГФК (рис. 13). При этом отсутствие изобестической точки перехода ФК в ДГФК и общее падение в поглощении можно было отнести за счёт выцветания полосы поглощения НАД-Н (А х 340 нм) при его окислении до НАД. исходный без облучения облучение 10 мин облучение 20 минИзменение спектра поглощения реакционной смеси 5x10"5 М ФК, 2,5х10"4 М НАД-Н в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0 при облучении УФ-светом (А, 350 ± 40 нм) в анаэробных условиях. Образование в фотореакции ТГФК подтвердили спектрофлуориметрические измерения, выявившие наличие в продуктах реакции характерной для ТГФК флуоресценции с А 03б = 295 нм и Л, = 360 нм. Спектральные данные были подтверждены методом бумажной хроматографии и ТСХ. Подвижность продуктов (Rf) и их флуоресценция совпадали с Rf и флуоресценцией свидетелей - ДГФК и ТГФК. Следует учитывать, что образование восстановленных форм ФК могло быть результатом фотохимической активности не только фолатов, но и НАД-Н [Красновский и др., 1980, Никандров и Красновский, 1978].
