Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ 7
A. Структурная организация хроматина эукари-
отических клеток 7
Б. Регуляция функциональной активности хроматина... 8
1. Организация функционально активных
участков хроматина 8
а) Обратимые процессы компактизации-
декомпактизации хроматина 10
б) Белковые спектры активного хроматина 13
2. Реорганизация хроматина при транскрипции 16
а) Транспорт белков из цитоплазмы в ядро 16
б) Модификация белков хроматина: ацети-
лирование 17
в) Протеолиз как механизм регуляции
активности хроматина 19
3. Регуляция транскрипции на уровне взаимо
действия РНК-полимераз с хроматином 22
а) Влияние сверхспирализации ДНК в хрома
тине на взаимодействие с'РНК-полиме
раз ой и транскрипцию..- 22
б) Стимуляторы РНК-полимеразной активности... 23
4. Стимуляция репликации хроматина..... 25
B. Структурно-функциональные изменения хрома
тина во время клеточного цикла 27
Общее состояние хроматина в покоящихся клетках 27
Переход G0 >- Gj- 27
Негистоновые белки и клеточный цикл 29
Гистоны и клеточный цикл 31
Полиплоидизирущие митозы 34
1'. Структурно-функциональные изменения хромати
на в клетках печени после частичной гепатэк-
т о:.иш . 36
Д. Структурно-функциональные изменения при голо
дании и введении циклогексимида 38
Заключение 47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48
Постановка задачи. 48
Глава П. МАТЕРИАЛЫ И МЕГ ОДЫ 51
Результаты 66
Глава Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ БИО
ГЕНЕЗА ЇР0ЩТИНА. СТИМУЛЯЦИЯ МАКРОМОЛЕШЯР-
НЫХ СИНТЕЗОВ И РЕПЛИКАЦИИ ДНК В ПЕЧЕНИ КРЫС
ВСЛЕДСТВИЕ ПОДАВЛЕНИЯ ТРАНСЛЯЦИИ 66
Глава ІУ. КИНЕТИКА БИОСИНТЕЗА И МОДИФИКАЦИИ
КОМПОНЕНТОВ ХРОМАТИНА 78
Синтез гистоновых и негистоновых белков хроматина после введения циклогексимида 78
Ацетилирование гистонов 84
3. Метаболизм гистонов в условиях ингибиро-
вания трансляции 87
а) Синтез гистонов 88
б) Транспорт и распад гистонов 88
в) Изменение прочности связей гистонов. .
в хроматине
Глава У. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АКТИВАЦИИ
ХРОМАТИНА В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ
ТРАНСЛЯЦИИ
Глава УІ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 121
ВЫВОДЫ 139
ЛИТЕРАТУРА 140
Введение к работе
Актуальность проблемы. С изучением механизмов, контролирующих пролиферацию клеток, связано решение таких фундаментальных проблем как нормальный и злокачественный рост, дифференцировка клеток, регенерация тканей, старение клеток. Исследование этих проблем лежит на пути познания принципов регуляции биосинтеза информационных макромолекул в клетках эукариот. Основу системы регуляции составляет замкнутый контур: ДНК-РНК-белок-ДНК, в котором система обратных связей в основном осуществляется белками. Факторы, способные изменять скорость или характер синтеза РНК и белков в покоящейся клетке, вызывают компенсаторные изменения в этом цикле. В результате клетка или возвращается к прежнему состоянию покоя, или вступает в пролиферацию. Поэтому изучение механизмов клеточной пролиферации представляет не только теоретическую, но и большую практическую ценность.
Однако многие детали этого процесса до сих пор не ясны. В частности, недостаточно изучены быстродействующие механизмы активации хроматина, играющие, по-видимому, определяющую роль на ранних (первые часы) этапах клеточной пролиферации. Этой проблеме посвящена значительная часть нашей экспериментальной работы.
Для изучения этапов клеточной пролиферации важным является выбор подходящего тест-объекта. Известно большое число клеточных систем со стимулированной пролиферацией, которые позволяют наблюдать изменения, характерные для различных фаз клеточной пролиферации. Нами предложена доступная, удобная и нетрудоемкая модель, в которой стимуляция пролиферации достигается однократным введением животным сублетальной дозы циклогексимида (ЦТИ), специфически блокирующего трансляцию. Эта модель позволяет исследовать механизмы взаимосвязи и взаимодействия матричных биосинтезов, а также струк-
турные и функциональные изменения хроматина, сопряженные с этими взаимодействиями.
Цель работы состояла в разработке сравнительно простой модели индукции синтеза ДНК в покоящихся клетках печени крыс с известным, в отличие от существующих моделей (например, модели частичной ге-патэктомии), пусковым механизмом, связанным с блокадой трансляции, на которой бы последовательно и дискретно активировались синтезы РНК, белков и ДНК. Разработанная нами модель позволила выявить некоторые закономерности взаимосвязи процессов трансляции, транскрипции и репликации, а также изучить состояние и активность хроматина при разных уровнях трансляции.
В задачи исследования входило выявление факторов, вызывающих переход клетки от состояния покоя в состояние активной пролиферации, а именно:
Подбором сублетальных доз циклогексимида четко разграничить активацию биосинтезов РНК, белков и ДНК по шкале времени, что облегчило бы возможность изучения процессов транскрипции, трансляции, и репликации.
Выяснить механизм активации хроматина в ранние часы после подавления синтеза белков циклогексимидом.
Исследовать динамику: а) синтеза и ацетилирования гистоновых и негистоновых белков; б) протеолиза гистонов; в) РНК-полимераз-ной активности в период стимуляции биосинтеза РНК.
Определить скорость транспорта ядерных белков из цитоплазмы в ядро.
Новизна работы
Предложен новый подход для исследования регуляции, матричных синтезов, основанный на явлениях стимуляции синтеза РНК, белков и ДНК в результате глубокого начального торможения биосинтеза бел-
b -
ков циклогексимидом. Максимумы активации биосинтеза этих макромо-... ллекул четко разграничены по шкале времени, что значительно облегчает возможность изучения взаимосвязи процессов транскрипции,трансляции и репликации.
На этой модели впервые выявлены два быстродействующих механизма активации хроматина: первый состоит в активации транспорта белков из цитоплазмы в ядро, второй - связан с ограниченным протеоли-зом ацетилированной формы гистона НЗ.
Показано, что время жизни слабосвязанных негистоновых белков, в том числе, белков ШЛО, коррелирует с продолжительностью периода повышенной активности РНК-полимеразы II.
В условиях действия ЦГИ идентифицировано два максимума синтеза гистонов, один из которых не сопряжен с синтезом ДНК.
Практическая ценность. Разработанная модель применима для изучения механизмов роста, пролиферации, и, в том числе, неограниченной пролиферации при злокачественной трансформации клеток. Полученные факты могут быть использованы для оценки ряда экспериментальных результатов, связанных с реакцией клетки на различные воздействия, нарушающие скорость синтеза белков, например, передозировка лекарств, радиационное поражение организма, голодание, ранние стадии: химического канцерогенеза.
Экспериментальная часть содержит три раздела: Материалы и методы (глава II), Результаты (главы III, ІУ, У) и Обсуждение (глава УІ). В главах ІІІ-УІ изложены результаты наших собственных экспериментов.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Института химической физики АН СССР и является частью исследований, посвященных изучению молекулярных механизмов сохранения белкового го-меостаза клеток высших животных.
