Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Введение 12
1.1. Физико-химические и каталитические свойства цитохрома Р-450 15
1.2. Физико-химические и каталитические свойства НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы 22
1.3. Топография, молекулярная организация и функциональные взаимодействия цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы 27
Глава 2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы исследований 52
2.2. Результаты исследований и их обсуждение
2.2.1. Реконструкция мембранной монооксигеназной системы из белков и липидов микросом печени 64
2.2.2. Встраивание изолированных ферментов в реконструированные микросомные мембраны 80
2.2.3. Бензпиренгидроксилазная активность реконструированных микросомных мембран и ее зависимость от молярного соотношения цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы 94
Заключение 119
Выводы 122
Практические рекомендации 124
Литература 125
- Физико-химические и каталитические свойства цитохрома Р-450
- Топография, молекулярная организация и функциональные взаимодействия цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы
- Реконструкция мембранной монооксигеназной системы из белков и липидов микросом печени
- Бензпиренгидроксилазная активность реконструированных микросомных мембран и ее зависимость от молярного соотношения цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы
Введение к работе
Важный процесс в жизнедеятельности организма составляет де-токсикация гидрофобных низкомолекулярных соединений эндогенного и экзогенного происхождения. Особый интерес представляет окислительная ферментативная система защиты от токсического действия гидрофобных соединений, находящаяся в эндоплазматических мембранах (микросомах) печени и ряда других органов и тканей человека и животных, содержащая в качестве терминальной оксидазы цитохром Р-450 (3). Роль этой ферментной системы, организованной в специализированную редокс-цепь, состоит в окислении гидрофобных молекул с помощью молекулярного кислорода, и функционирует она как монооксигеназа внешнего типа.
В настоящее время известно, что микросомная монооксигеназная система подвергает биотрансформации многочисленные, самые различные по своей химической природе и биологической активности чужеродные химические соединения (ксенобиотики) - лекарства, яды, канцерогены, химические факторы загрязнения окружающей среды и т.д. (3, 15, 18, 167). Ежегодно увеличивается поток ксенобиотиков, вызванный увеличением производства и потребления лекарств, нарастающим загрязнением биосферы химическими соєдинениями в результате увеличения производства новых химикатов, пищевых добавок, пестицидов и т.д. В связи с огромной практической важностью микросомной монооксигеназной системы в защите живых систем от токсического действия ксенобиотиков возрос интерес исследователей многих специальностей к вопросам ксенобиохимии.
В последние годы стало известно, что наряду с детоксикацией окисление некоторых соединений в микросомной монооксигеназной системе сопровождается токсификацией - образованием промежуточ-
ных электрофильных продуктов, имеющих токсический, мутагенный или канцерогенный эффект, цитохром Р-450-зависимая активация предшествует канцерогенному и токсическому действию таких соединений, входящих в состав загрязнений окружающей среды, как полициклические ароматические углеводороды, нитрозамины (167).
Широкая субстратная специфичность микросомнои монооксигеназной системы, как стало ясно в последние годы, обусловлена существованием ключевого фермента - цитохрома Р-450, в виде множественных молекулярных форм (78, 137, 190). Проблема множественности форм цитохрома Р-450 представляется настоящее время одной из главных в ксенобиохимии. И хотя она еще далека от окончательного решения, уже сейчас очевидно, что именно множественные формы цитохрома Р-450 представляют собой главный фактор, определяющий фармакологические, токсилогические, мутагенные и канцерогенные свойства ксенобиотика в организме (167).
Среди различных направлений современной ксенобиохимии наибольший интерес представляют также исследования механизма моно-оксигеназных реакций, строения активного центра цитохрома Р-450, механизмов индукции монооксигеназ лекарственными веществами и канцерогенными полициклическими углеводородами, молекулярной организации ферментов монооксигеназ (15, 16, 18). Изучение этих вопросов направлено на формирование точных представлений о роли микросомнои цитохром Р-450-содержащей монооксигеназной системы в метаболизме чужеродных соединений и, в конечном итоге, о возможности регуляции метаболических реакций окисления, осуществляемых ею.
Главные компоненты микросомнои монооксигеназной системы -цитохром Р-450 и НДЩШ-цитохром Р-450 редуктаза, являются мем-браносвязанными ферментами (3, 15, 59). Транспорт электронов
между этими ферментами является ключевым этапом в монооксигеназ-ных реакциях. В микросомах цитохром Р-450 и ВДФН-цитохром Р-450 редуктаза представлены в таких количествах, что на одну молекулу редуктазы приходится 20-30 молекул цитохрома (58, 59). Вопрос об особенностях молекулярной организации ферментов монооксигеназной системы, решению которого посвящены многочисленные исследования последнего десятилетия, не решен окончательно.
Ряд исследований, выполненных с использованием реконструированной растворимой (немембранной системы), содержащей изолированные из микросом цитохром Р-450 редуктазу, свидетельствует о том, что, в такой системе цитохром окисляет субстраты с наивысшей скоростью при эквимолярном соотношении с редунтазой (62, 155). Принимая во внимание данные о соотношении этих двух участников моно-оксигеназных реакций в интегрированных микросомных мембранах, представляется важным провести подобное исследование в монооксигеназной системе, ферментные компоненты которой находятся в мем-браносвязанном состоянии. Изучение этого аспекта функционирования микросомной монооксигеназы связано с проблемой множественных форм питохрома Р-450, так как цитохром Р-450 в микросомах представлен суммой форм (86, 171, 190, 207).
Изложенное выше определило цель и задачи исследования. Целью наотоящей работы было исследование зависимости эффективности монооксигеназной реакции, катализируемой определенной индивидуальной формой питохрома Р-450, в микросомной мембране от молярного соотношения этой формы с ВДФН-цитохром Р-450 редуктазой. При решении этого вопроса представлялось обязательным выполнение нескольких условий: во-первых, необходимость методического подхода для получения микросомных мембран, в которых содержание исследуемой формы регулируется в широких пределах; во-вторых, возможность определения количества исследуемой формы цитохрома Р-450 в мем-
братах микросом; в-третьих, возможность определения в микросом-ных мембранах участия и вклада исследуемой формы цитохрома Р-450 в достаточно специфичную для нее монооксигеназную реакцию, несмотря на возможное участие в этой реакции других форм цитохрома, присутствующих в микросомной мембране.
В соответствии с этим были поставлены следующие конкретные задачи:
Разработать метод реконструкции мембранной монооксигеназ-ной системы из микросомных белков и фосфолипидов, максимально приближенной по свойствам, в том числе по уровню метаболизма ксенобиотиков, к нативным микросомным мембранам.
Получить очищенную НАДФН-цитохром Р-450 редуктазу, активную в отношении природного акцептора - цитохрома Р-450, способную встраиваться в мембранные матрицы.
Встроить очищенные ферменты - формы цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазу в реконструируемые микросомные мембраны и охарактеризовать ферментный состав мембран и их функциональную активность.
Определить содержание МХ-индуцируемой формы цитохрома Р-450 (Р-448) и охарактеризовать ее участие в реакции гидрокси-лирования бензпирена в микросомных мембранах с различным содержанием цитохрома Р-448 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы.
Научная новизна. Для реконструкции мембранной монооксигеназ-ной системы впервые применен сефадекс ьн -20, обладающий выраженными липофилышми свойствами. Реконструкция путем самосборки при гель-фильтрации солюбилизированных микросомных белков и фосфолипидов через сефадекс ьн-20 осуществляется с высокой эффективностью, и в результате формируются мембраны, подобные по структурным и функциональным характеристикам исходным микросомным мембранам.
Показана возможность направленного изменения содержания щтохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы в реконструированных микросомных мембранах при встраивании очищенных ферментов в процессе самосборки мембранных структур.
В работе применен новый подход для определения эффективности катализа монооксигеназной реакции индивидуальной формой цито-хрома Р-450 в мембраносвязанном состоянии в присутствии других форм, основанный на применении моноспецифичных антител против этой формы цитохрома Р-450 для оценки степени ее участия в метаболизме субстрата по данным ингибирущего влияния антител на скорость исследуемой реакции. Моноспецифичные антитела против исследуемой формы цитохрома были использованы также для ее количественного определения в микросомной мембране.
Получены данные о зависимости скорости гидроксилирования бензпирена метилхолантрен-индуцируемой формой цитохрома Р-450 в мембранной монооксигеназной системе от молярного соотношения этой формы цитохрома и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы, свидетельствующие об оптимальном для наиболее эффективного гидроксилирования соотношения этих ферментов, значительно превышащим эквимо-лярное.
Практическая значимость. По своему содержанию работа представляет экспериментальное изучение функциональных взаимоотношений компонентов микросомной цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы и носит преимущественно теоретический характер. Значение ее в рамках данной проблемы заключается в установлении новых фактов о функциональной активности мембраноорганизованной монооксигеназной системы с различным содержанием ее ферментных
компонентов.
Показанная зависимость эффективности метаболизма субстрата индивидуальной формой цитохрома Р-450 в мембранной монооксигеназной системе от молярного соотношения этой формы цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы, демонстрирует важность данного параметра в мембранных модельных системах, используемых для изучения активности монооксигеназной системы, эффективности метаболических процессов, осуществляемых ею.
Разработанный метод реконструкции мембранной монооксигеназной системы с помощью гель-фильтрации солюбилизированных белков и фосфолипидов микросом через сефадекс LH-20 в настоящее время используется в лабораториях СО АМН и СО АН СССР, изучающих системы метаболизма ксенобиотиков.
Работа выполнена в рамках Всесоюзной программы "Гидрокси-лаза" в соответствии с плановой темой, утвержденной Государственным комитетом СССР по науке и технике (ft государственной регистрации 79040821).
Основные положения диссертации, которые выносятся на защиту.
I. Реконструкция мембраноорганизованной микросомной монооксигеназной системы путем самосборки из солюбилизированных микросомных белков и фосфолипидов, имеющей физико-химические характеристики, близкие к характеристикам исходных мембран микросом, возможна при удалении солюбилизирукхцего агента с помощью гель-фильтрации через сефадекс LH -20
Использование очищенных ферментов ..микросом (форм пито-хрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы) позволяет получать реконструированные микросомные мембраны с дополнительно встроенными молекулами ферментов, и, таким образом, изменяемым количеством и соотношением этих ферментных компонентов.
Оптимальное соотношение метилзюлантрен-индуцир/"уемой формы цитохрома Р-450 (цитохрома Р-448) и НАДФН-пдтохром Р-450 редуктазы, при котором цитохром гидроксшшрует бензпирен с максимальной скоростью в мембранной монооксигеназной системе, отличается от эквимолярного.
Самостоятельность выполненной работы. Основная часть представленных в работе данных получена лично автором. Эксперименты по изучению температурных фазовых переходов выполнены совместно с сотрудником лаборатории клеточных механизмов адаптпции Института клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР А.ЇЇ. Ивлевым-Дунтау.
ЭПР-спектрометрические измерения и измерение размеров мик-росомных частиц методом рассеивания лазерных лучей выполнены сотрудником Института химической кинетики и горения СО АН СССР СИ. Еременко.
Препараты изолированных цитохромов Р-450 и антитела против МХ-цитохрома Р-450 получены сотрудниками лаборатории клеточных механизмов адаптации Института клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР І.Ф. Гуляевой, Н.И. Гуткиной, СИ. Макаровой.
Автор выражает большую признательность старшему научному сотруднику В.М. Мишину за конструктивные предложения по содержанию работы и обсуждение полученных результатов.
Автор благодарит доктора биологических наук, профессора В.В. Ляховича за руководство работой.
Физико-химические и каталитические свойства цитохрома Р-450
Ключевым ферментом НАДФН-зависимой монооксигеназной системы, метаболизирущей эндогенные субстраты и разнообразные ксенобиотики, является цитохром Р-450. Цитохром Р-450 содержится в мнкросо-мах печени в количестве, составляющем 15-20 % общего белка (57) -это наивысшее содержание среди других ферментов. Цитохром Р-450 является гемопротеином ъ-типа, отличающимся аномальным положением полосы Соре его карбонильного комплекса в восстановленном состоянии на 450 нм (163, 164).
Функция цитохрома Р-450 в качестве терминальной оксидазы состоит в способности активировать молекулярный кислород. Эта способность определяется электрон-донорскими свойствами отрицательно заряженного серосодержащего цистеинового остатка 5-го аксиального лиганда железа гема ( 18 ).
Кроме этого цитохром Р-450 является субстрат-связывающим ферментом монооксигеназной системы (130, 131, 133) и, таким образом, определяющим ее субстратную специфичность. Специфичность цитохрома Р-450 обеспечивается, очевидно, его акспальными лигандами и третичной структурой, свойственной каждому индивидуальному белку ( 190).
Субстраты образуют с цитохромом Р-450 комплексы, дифференциальный спектр которых характеризует два типа связывания. Образование спектральных изменений I типа с максимумом поглощения на 385 -390 нм и минимумом на 420-422 нм отражает связывание субстрата с апоферментом цитохрома Р-450 (125). К субстратам I типа относится подавляющее большинство ксенобиотиков и все эндогенные субстраты монооксигеназ. Субстраты П типа образуют спектральный комплекс с максимумом поглощения на 425-435 нм и минимумом на 390-395 нм.
Эти субстраты замещают лиганд в гемовом железе с образованием фер-ригемохрома (177, 192).
Цитохром Р-450 существует в двух спиновых состояниях - высоко-и низкоспиновом, и характеризуется анизотропным сигналом ЭПР как в том, так и в другом состоянии (87, 147). Окисленный цитохром в низко-спиновом состоянии в абсолютном спектре имеет максимум поглощения на 416 нм, в высоко-спиновом состоянии - на 400 нм.
Окисленный цитохром Р-450 в различных объектах существует в виде смеси этих двух форм. Низкоспиновое состояние, как более устойчивое, преобладает в обычных условиях. Различные воздействия (индукция ксенобиотиками, связывание субстратов I типа, изменение рН, восстановление) сдвигают равновесие (4, 16 ).
Характерное свойство цитохрома Р-450 - его сильная гидрофоб-ность около 50 % его аминокислотных остатков относится к неполярним (55), и около 40 % - к полярным (63). Фермент имеет тенденцию к полимеризации в растворе в очищенном состоянии с образованием агрегатов с молекулярным весом от 300000 до 50 0000 дальтон (27, 78). Степень агрегации зависит от таких факторов, как наличие детергентов и липидов.
Важнейшим свойством микросомного цитохрома Р-450 является то, что это интегральный мембранный белок, свойства которого в значительной мере зависят от составляющих мембрану компонентов (15, 99). Его спектральные свойства в нативной форме и каталитическая активность обеспечиваются, прежде всего, гидрофобным окружением фосфо-липидного матрикса микросомной мембраны (15, -2). Показано, что фосфолипиды мембран поддерживают фермент в конформационно-активном состоянии - фосфолипидный бислой оказывает стабилизирующее действие на цитохром Р-450, уменьшая ее конформанионную подвижность ( 4 ).
Представление о том, что цитохром Р-450 является мембраносвязанным белком, подтверждается данными о его устойчивости к выделению из микросомной мембраны при обработке многими реагентами, за исключением детергентов, солюбилизирующий эффект которых состоит в их способности взаимодействовать с гидрофобными участками белка ( 132 ).
Цитохром Р-450 обладает выраженной лабильностью. Ряд воздействий приводит к появлению обычной для гемопротеидов ъ -типа формы с полосой поглощения на 420 нм и полной потере каталитической активности (165). Среди агентов, вызывающих конверсию цитохрома Р-450 в энзиматически неактивную форму Р-420 могут быть вещества воздействующие на фосфолипидн - фосфолипаза А, алифатические спирты, детергенты (2, 94, 165) и вещества, воздействующие на белок -трипсин, мочевина, гуанидин, анилин и т.д. (15, 94, 102).
Первые попытки солюбилизации микросом с применением детергентов приводили к конверсии цитохрома Р-450. Было показано, что превращение в неактивную форму Р-420 может быть предотвращено использованием глицерина, стабилизирующего цитохром Р-450 (94).
Впервые солюбилизировали монооксигеназную систему микросом печени кролика Лу и Кун в 1968 г. (128), используя в качестве детергента дезоксихолат натрия. Солюбилизированные микросомы были разделены хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе на 3 компонента: цитохром Р-450, НДЦФН-цитохром с редуктазу и термостабильный фактор, который впоследствии был идентифицирован как фосфатидилхолин (204). Цитохром Р-450 имел специфическое содержание 5-6 нмолей на мг белка, обладал ферментативной активностью, но был загрязнен другими белками микросом. Гомогенные фракции цитохрома Р-450 с очисткой около 17 нмоль на мг белка впервые были получены из ФБ-индуциро-ванных микросом печени кроликов в 1974 г. двумя разными методами - методом аффинной хроматографии (99) и фракционированием полиэти-ленгликолем 6000 и последовательными хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе, гидроксилапатите и кальций-фосфатном геле (213).
Впоследствии процедура получения очищенных функционально активных ферментов монооксигеназ претерпела значительные изменения, и разработанные к настоящему времени методы выделения позволяют получать ферментные препараты с высоким специфическим содержанием, хорошим количественным выходом и молекулярной активностью. Прогресс в. очистке цитохрома Р-450 связан, во-первых, с применением неионных детергентов Эмульгена 911 и 913, Луброла РХ (132), которые хорошо отделяют его от других белковых компонентов микросомной мембраны; во-вторых, с использованием аффинной хроматографии на 1,8-диаминооктил сефарозе 4В (95, 99, 115), т.к. известно, что н-октиламин является сильным лигандом цитохрома Р-450 в окисленном состоянии (III); изменением температуры проведения ионообменной хроматографии (219) и использованием современных ионообменников (189).
Топография, молекулярная организация и функциональные взаимодействия цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы
Как показывает анализ литературных данных, строение и функция НіДФН-специфического флавопротеина в значительной мере изучены, о строении цитохрома Р-450 известно меньше, но функция его как терминальной оксидазы монооксигеназных реакций не вызывает сомнений. Вопрос же о молекулярной организации этих ферментных компонентов микросомной монооксигеназной системы остается пока до конца нерешенным.
В настоящее время ясно, что практически все биологические мембраны, в том числе и мембраны эндоплазматического ретикулума, асимметричны в поперечном плане в отношении их белковых компонентов, а именно, композиция белков на внешней половине мембраны отличается от композиции на внутренней стороне (50, 158, 159).
Исследования, направленные на выявление топографии электрон-переносяших белков эндоплазматического ретикулума интенсивно развивались в течение последних 10 лет.
При изучении поперечной топографии мембран одним из наиболее распространенных приемов служит обработка протео- или липотичес киш ферментами (12, 159, 160). Применение этого методического приема продемонстрировало асишлетричное распределение микросомных ферментов в поперечном плане мембраны. Исследуя динамику солюбили-зации белковых компонентов микросомных мембран под действием протеази К, Девиченский с соавт. (12) показали, что 35 % всех белков мембраны солюбилизируются низкой концентрацией протеазы К и около 50 % - при высоких. Такая дополнительная солюбилизация вероятнее всего свидетельствует об удалении полярных фрагментов белков, встроенных во внутреннюю поверхность мембраны. Оставшиеся белки становятся доступными для протеазы после обработки мембран фосфо-липазой Ag. Всего же в микросомной мембране около 30 % мембранных "белков защищено фосфолипидом от протеазной атаки.
Используя метод обработки микрооом протеазами, Нильсон и др. (158, 160) показали, что цитохром Ъ и НАДФН-цитохром Р-450 ре-дуктаза локализованы на цитоплазматической поверхности микросомной мембраны (показано обработкой трипсином, неспецифической про-теазой и непроникающим химическим реагентом диазобензен сульфона-том). Цитохром Р-450 гомогенно распределен в поперечном плане мембраны, так как он частично инактивируется трипсиновой обработкой как с внутренней, так и с внешней стороны мембраны и частично резистентен к протеолитической обработке с обоих сторон (158). По данным Купера и др. (41, 44) 50 % цитохрома Р-450 находится на внешней поверхности микросомной мембраны.
Концентрация НДДФН-зависимого флавопротеина в мембранах микро-сом мала относительно концентрации гемопротеинов цитохромов bg и Р-450; на одну молекулу ШЩФН-зависимого флавопротеина приходится 20 молекул цитохрома Р-450 (в зависимости от вида животного, органа и предшествующей индукции может быть до 40 молекул цитохрома Р-450) и 10 молекул цитохрома Ъ5 (58, 59).
Значительный интерес к вопросу о пространственной организации компонентов микросомной электрон-транспортной системы в мембране был проявлен после работ Эстабрука с соавторами (57). Франклина и Эстабрука (61), впервые предположившими существование жесткой связи между цитохромом Р-450 и НДЦФН-зависимой редуктазой, формирующий индивидуальные электрон-транспортные комплексы.
Франклин и Эстабрук (61), исследуя влияние мерселила - ингибитора НАДФН-зависимой редуктазой активности, на метаболизм этилмор-фина, показали, что активность НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы и метаболизм этилморфина ингабируется при одной и той же концентрации мерсалила, из чего, по мнению авторов, следовало, что редукта-за образует отдельные жесткие комплексы с молекулами цитохрома -"кластеры", внутри которых она снабжает редуцирующими эквивалентами цитохром Р-450.
Штиер и Сакманн (202), изучая температурные зависимости поведения микросомных фосфолипидов с помощью двух спин-меченных полярного и гидрофобного соединений показали, что основная масса микросомных фосфолипидов мембранного матрикса не претерпевает фазовых переходов в интервале температур от 5 до 47С, а часть фосфолипидов (не более 20 %) находится в более ригидном состоянии и претерпевает фазовый переход из жидко-кристаллического в жидкое состояние при температуре 32С. Исследуя зависимость характеристики ЭПР-спектра гидрофобного зонда от температуры в присутствии ЕАДФН, авторы заключили, что цитохром Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редук-таза локализованы в этой более ригидной специализированной зоне микросомных фосфолипидов, которые входят в состав комплекса с ферментными компонентами. Авторы постулировали, что кластеры цитохрома Р-450 и редуктазы в фосфолипиде представляют собой наиболее адекватную модель структурной организации монооксигеназных компонентов.
Позднее Штиер с соавторами (198) с помощью ЯМР спектров -ЧР-меченых липидов показали, что кроме липидов, организованных в ламе-лярные структуры, часть мембранных липидов, в частности фосфатидил-этаноламин, представлены в форме инвертированных мицелл ж необходимы для встраивания в мембрану ферментных компонентов цитохром Р-450-содержащей системы и ее функционирования, так как определяют их конформацию и агрегацию в мембране.
Петерсон с соавторами (168), исследуя температурную зависимость реакции ШЩФН-завиеимого восстановления цитохрома Р-450, протекающей в две стадии (65, 149) показали, что в интервале температур от 4 до 37С график зависимости логарифма константы скорости быстрой фазы восстановления в координатах Аррениуса представляет линейную зависимость. Аналогичный график для константы скорости медленной фазы имеет перелом в области І9С. В присутствии гидрофильных субстратов график Аррениуса для быстрой фазы переломов не имеет, для медленной фазы характерен перелом при 19. В быструю фазу при температуре ниже 22С восстанавливается 40-55 % общего цитохрома Р-450, выше 22 до 37 - 70-75 %.
Эти данные позволили авторам предложить модель организации мо-нооксигеназного комплекса в микросомной мембране. Отсутствие температурного перелома в координатах Аррениуса и изменения энергии активации в быструю фазу восстановления цитохрома Р-450 редуктазой при различных температурах предполагает жесткое связывание реагирующих компонентов в комплексе - кластере.
Реконструкция мембранной монооксигеназной системы из белков и липидов микросом печени
Разделение мембранных компонентов и последующее восстановление мембранных структур и свойственных им функций, называемое "самосборкой", представляет собой ценный подход для исследования молекулярной организации и функционирования мембраносвязанных ферментов и занимает видное место в работах с плазматическими и митохонд-риальными мембранами (175, 176).
В обзоре Разина (176) достаточно полно описаны методические приемы самосборки биомембран и показаны решения некоторых проблем, относящихся к окислительному фосфорилированию в митохондриях, кальциевому насосу в саркоплазматическом ретикулуме.
Вместе с тем, система микросомных ферментов, метаболизирующих ксенобиотики не подвергалась интенсивному исследованию методом самосборки, несмотря на его перспективность и информативность. По-видимому, Арчаков и соавторы (4, 5, 24, 25) первыми предприняли такую попытку. Авторы показали, что после солюбилизации микросом печени крыс холатом натрия и последующего длительного диализа, образуются мембраноподобные структуры, содержащие микросомные переносчики электронов и осуществляющие метаболизм ксенобиотиков (4).
При выбранных авторами условиях солюбилизации наблюдалась выраженная конверсия цитохрома Р-450 в цитохром Р-420, которая частично преодолевалась при последующей самосборке, то есть происходила частичная "реконверсия" цитохрома Р-420 и Р-450. Этим объяснялось относительно слабое восстановление метаболизма ксенобиотиков. Показано, что включение в среду солюбилизации микросом 20 % глицерина предотвращает конверсию цитохрома Р-450 в цитохром Р-420 (23). Использование метода диализа для удаления детергента при таких условиях позволило получить микросомоподобные частицы, метаболизиру-ющие ксенобиотики аминопирин и анилин с эффективностью в пределах 30 % от исходного уровня метаболизма (212). Кроме того, было показано, что самосборка монооксигеназной системы из солюбилизирован-ных микросом печени мышей, индуцированных 3-метилхолантреном, сопровождается восстановлением метаболизма бенз(а)пирена до 70 % от исходного уровня (140).
В литературе имеются данные о самосборке мембранных ферментных систем после того, как солюбилизирующий агент удалялся с помощью гель-фильтрации (64, 185). Авторы этих работ отмечали определенные преимущества этого метода перед диализом. Гайлор и Делвич (64) продемонстрировали, что гель-фильтрация микросомного солюбилизата, полученного обработкой тритоном Х-ЮО, через липофильный сефадекс ш-20 , приводит к почти полному отделению детергента от микросомного белка.
Предваряя изложение экспериментальных данных целесообразно кратко остановиться на терминологических понятиях, относящихся к процессам диссоциации мембранозависимых ферментных систем и ассоциации их в функционально активные комплексы.
В своем обзоре Разин (176) пишет: "В идеале, исследования по восстановлению (биомембран) должны включать: I) солюбилизацию биомембран на составляющие части; 2) биохимическую и биофизическую характеристику солюбилизированных продуктов; 3) их соединение вновь в мембраны, идентичные с нативными мембранами по структуре и функции. Это кажется единственным прямым и содержательным путем, приводящим к доказательствам относительно упорядоченных метаболических путей в биомембранах...".
В настоящее время общепринятым и наиболее часто применяемым методическим подходом для солюбилизапии мембран является обработка их детергентами (176). В настоящей работе для этого был использован холат натрия.
Как отмечает Разин (176), во многих работах, посвященных самосборке мембранозависимых ферментных систем, не представлены данные, характеризующие степень солюбилизапии исходного материала. Для того, чтобы показать, что в выбранных нами условиях происходит истинная солюбилизация, был проведен ряд экспериментов. Сразу отметим, что солюбилизированной фракцией микросом, служащей исходным материалом для самосборки, мы называем неосаждаемую при центрифугировании (150 000 g х 90 мин) часть общего солюбилизата микросом. Неосаждаемость является нечетким, но достаточно распространенным критерием солюбилизапии (176).
Как видно из рис. I, солюбилизированная фракция микросом четко делится на белки и фосфолипиды при гель-хроматографии на био-геле Р-30 в присутствии 4 % холата натрия. Это показывает, что подавляющая часть белков и фосфолипидов отделены друг от друга.
Особенности солюбилизирующего действия в зависимости от концентрации детергента были продемонстрированы хроматографией на био-геле А 1,5 m . На рис. 2а представлена картина гель-хроматографии на био-геле А 1,5 m солюбилизированной фракции микросом в присутствии 4 % холата натрия. Видно, что появление белков в элю-атах начинается во фракциях, выходящих вслед за свободным объемом.
Бензпиренгидроксилазная активность реконструированных микросомных мембран и ее зависимость от молярного соотношения цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы
Как отмечалось, диализ и гель-фильтрация на различных типах сефадексов наиболее часто используется для отделения детергента и последующей самосборки (176). Тем не менее многие авторы отмечают трудности отделения детергентов как тем, так и другим способом. Однако, гель-хроматография обладает рядом преимуществ по сравнению с диализом. Одно из них - быстрота проведения эксперимента. Кроме экономии времени, более важным моментом можно считать существенное уменьшение времени воздействия детергента на белки мембран. Основное же преимущество гель-хроматографии состоит, по-видимому, в более полном отделении детергента от микросомных белков и фосфо-липидов. Последнее хорошо демонстрируется хроматографией на биогель А 1,5 m (рис. 2), которая показывает,, что количество белка частиц с большой молекулярной массой обратно пропорционально концентрации холата натрия в элюирующей среде.
В наших опытах выход белка микросомоподобных частиц составлял 40-80 %, что позволяло выполнять эксперименты, отличающиеся большим расходом микросомного белка.
Два обстоятельства заслуживают, на наш взгляд, особого внимания. Широко известны работы, демонстрирующие монооксигеназную активность в системах, состоящих из предварительно выделенных и очищенных цитохрома Р-450, ЕАДФН-цитохром Р-450 редуктазы и липид-ного материала. Специальными исследованиями (27) было показано, что данные микросомные компоненты образуют комплексы с МОЛЄКуЛЯр-ным весом 5,0 . 10й дальтон, в которых на одну молекулу цитохрома Р-450 приходится одна или две молекулы НДЦШ-цитохром Р-450 редуктазы и 20 молекул фосфолипида, хотя известно, что в микросомах печени на I молекулу ШЩФН-цитохром Р-450 редуктазы приходится 10-20 молекул цитохрома Р-450 (59). Также подчеркивалось, что образование растворимой реконструированной системы из предварительно изолированных ферментов и фосфолипидов не сопровождается формированием каких-либо мембранных структур (27). В связи с этим можно сделать вывод, что реконструированная микросомоподобная мембранная система, описанная в настоящей работе, резко отличается от реконструированной системы микросомных ферментов, описанной Лу и Куном (128). Это отличие касается такого важного свойства, как мембранозавиоимая интеграция микросомной монооксигеназной системы.
Интересным также представляется факт "сверхвстраивания" цито-хрома Р-448 при самосборке частиц из 3-МХ индуцированных микросом. В настоящее время не вызывает сомнения факт существования в микросомах различных по свойствам форм цитохрома Р-450 (137). Показано, что цитохром Р-448 имеет более гидрофобное микроокружение гемовой группы, чем цитохром Р-450 (102). Учитывая эти данные кажется возможным предположить, что цитохром Р-448, метаболизирую-щий бензпирен, благодаря своим более выраженным гидрофобным свойствам, преимущественно встраивается в мембрану 3-МХ микросом в процессе самосборки.
Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что гель-фильтрация через сефадекс ьн-20 солюбилизированной фракции микросом, в которой компоненты монооксигеназной системы физически отделены друг от друга, приводит к образованию структурированных частиц, весьма сходных с исходным объектом для солюби-лизации - микросомами печени крыс, по размерам, состоянию фосфо-липидной фазы, количеству микросомных переносчиков электронов. Кроме того, образование структурированных частиц сопровождается восстановлением реакций метаболизма ксенобиотиков.
В обзоре Разина (176) отмечается, что в процессе самосборки можно качественно и количественно управлять набором компонентов исследуемой системы, что дает возможность ответить на.вопросы о главных стадиях реакции, скоростьлимитирущих факторах, аллосте-рических эффектах, о взаимодействии и роли отдельных компонентов.
В настоящее время представляется доказанным, что ферментами монооксигеназ, в конечном итоге ответственными за качественные и количественные параметры окислительного метаболизма ксенобиотиков, являются множественные формы цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза. Поэтому очевидно, что для ответа на вопрос о взаимодействии этих основных ферментных компонентов монооксиге-назной системы и принципа ее организации реконструкция микросом-ных мембран с изменяемым содержанием этих ферментов методом самосборки может быть перспективным подходом.
В литературе описано два основных приема по изменению соотношения цитохромов Р-450 и ЕАДФН-цитохром Р-450 редуктазы в мембранной монооксигеназной системе: встраивание ферментов в интактные микросомы (156, 238) и встраивание в липосомы, приготовленные из фосфолипидов различного происхождения (83, 206). Нами предлагается прием встраивания экзогенных изолированных микросомных ферментов при самосборке мембран микросом после их солюбилизации 4 % холатом натрия и гель-фильтрации через сефадекс ш-20.
Предваряя описание экспериментов по встраиванию изолированных ферментов в микросомную матрицу в процессе самосборки, уместно отметить, что нами был модифицирован способ выделения очищенной НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы из микросом печени крыс.
Как следует из анализа литературных данных о получении высокоочищенных препаратов этого фермента, процесс очистки состоит обычно из нескольких последовательных хроматографии в присутствии детергентов. Способ выделения в существенной степени определяет каталитические характеристики очищенной НАДФН-цитохром Р-450 редук-тазы, а именно, лишь использование в качестве солюбилизирующего агента детергентов таких, как ренекс-690, эмульген 911, луброл РХ дезоксихолат (51, 52, 128, 216, 217, 239) позволяет получить из микросом функционально активный ВДДФН-зависимый флавопротеин, способный восстанавливать свой природный акцептор - цитохром Р-450, и поддерживать метаболизм ксенобиотиков в растворимой реконструированной системе.
