Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность к целенаправленной подвижности является одной из отличительных характеристик живых организмов любого уровня сложности. В основе сократительной активности всех типов мышечных тканей лежит энергозависимое продвижение миозиновых филаментов относительно актиновых нитей. Эта же способность актина и миозина обусловливает подвижность немышечных клеток, их миграционную активность, внутриклеточный транспорт, секрецию, кэппинг рецепторов на поверхности мембран и другие процессы жизнедеятельности клеток. Ключевым регуляторным ферментом, контролирующим активность актомиозинового аппарата гладких мышц и немышечных тканей, является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ). КЛЦМ фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина, что приводит к активации АТФ-азы миозина и способствует гамосборке миозиновых филаментов. В отличие от гладких мышц и немышечных клеток, в поперечнополосатой мускулатуре взрослого организма КЛЦМ играет лишь подстроенную роль (Sweeney et al , 1493). Однако, она, по-видимому, необходима на ранних стадиях эмбриогенеза в период формирования саркомеров, а также в процессе гипертрофии или регенерации мышечных волокон (Aoki et al„ 2000; Libera et al., 1997).
Рис.1 Продукты генетического локуса КЛЦМ (по Watterson et 1995; liirukov et al..
1998).
Генетический локус КЛЦМ имеет сложное строение. Помимо классической КЛЦМ (MB = 108 кДа) он кодирует два других продукта - высокомолекулярную изоформу КЛЦМ (MB = 210 кДа) и белок KRP (Kinase-Related-Protein) с молекулярным весом 17 кДа (Рис.1) Первичная структура КЛЦМ-2ІС полностью включает в себя аминокислотную последовательность КЛЦМ-108, а также содержит уникальную N-концевую последовательность (Watterson et al, 1995). Аналогично, аминокислотная последовательность KRP идентична С-кокцевому домену КЛЦМ (Collinge et al., 1992). Ген KRP находится внутри гена КЛЦМ и имеет собственный промотор, расположенный в интроне гена КЛЦМ (Collinge et al, 1992). Промоторные участки гена КЛЦМ пока не идентифицированы, и остается
2 непонятным, являются ли изоформы КЛЦМ продуктами альтернативного сплайсинга или
экспресснруготся с различных промоторов.
Данные литературы свидетельствуют, что все продукты генетического локуса КЛЦМ вовлечены в регуляцию актомиозинового аппарата KRP стабилизирует филамситы гладкомышечного миозина, предотвращая их деполимеризацию под дейстпием физиологических концентраций АТФ за счет связывания с молекулами миозина и перевода их в развернутую конформацию (Shirinsky et al., 1993). Согласно сообщению Katayama и соавторов (Katayama et al.,1995), другой мажорный миозин-связывающий белок - кальдесмон - также обладает KRP-подобными свойствами. Однако, кальдесмон не влияет на конформационные переходы миозина и механизм его стабилизирующего действия на филамепты миозина требует дальнейшего изучения.
Функциональные свойства КЛЦМ-210 исследованы крайне мало, что, в частости, определяется отсутствием методов выделения этого белка. Установлено, что КЛЦМ-210 может фосфоршшровать РЛЦ миозина (Gallagher et al., 1995, Garcia et al., 1997), однако, соотношение ее активности с активностью КЛЦМ-108 не известно Наконец, в литерагурс полностью отсутствуют данные о функциональных свойствах и регуляторних элементах, связанных с уникальной аминокислотной последовательностью КЛЦМ-210. Вместе с зем очевидно, что именно эта часть молекулы должна определять ее специфические свойства
Цель и задачи исследований На основании вышесказанного, целью настоящей диссертационном работы явилось: изучение функциональных свойств белков - продуктов генетического локуса КЛЦМ. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияния миозин-связывающпх белков KRP и кальдешона на процесс полимеризации гладкомышечного миозина in vitro
-
Разработать метод выделения КЛЦМ-210 из гладких мышц аорты и исследовать ее функциональные свойства.
-
Изучить взаимодействие уникального домена КЛЦМ-210 с белками цитоскелета у возможность регуляции этих взаимодействий фосфоршшрованием.
Научная новизна работы. Впервые выделена в чистом виде высокомолекулярна? изоформа КЛЦМ-210 и исследованы ее свойства. Показано, что КЛЦМ-210 обладает фосфотрансферазной активностью по отношению к РЛЦ в составе миозиновой молекулы, сравнимой с удельной активностью КЛЦМ-108. Установлено, что КЛЦМ-210 связывается с актином и, посредством своего KRP домена, с миозином. Впервые исследованы свойств; уникального домена КЛЦМ-210 in vitro, и установлено, что он связывается с актином вызывая образование пучков Ф-актина. Показано, что уникальный домен КЛЦМ-2К способен взаимодействовать с кератином in vitro, что может указывать на роль КЛЦМ-210 і
інтеграцин актомиозинового шітоскелета и промежуточных филаментов. Впервые показано, по уникальный домен КЛЦМ-210 может быть фосфорилирован in vitro цАМФ-зависнмой іротеинкиназой по Сер-127 н Сер-140, что приводит к ослабленню его взаимодействия с ктином и кератином.
Исследовано влияние KRP и кальдесмона на полимеризацию миозина гладких мышц )бнаружено, что при совместном действии KRP и кальдесмон могут контролировать размер
количество миозиновых филаментов, а также существенно ослаблять их склонность к грегашш.
Практическая значимость работы. Результат данной работы способствует более лубокому пониманию механизмов регуляции сокращения гладких мышц и подвижности емышечных клеток. Полученные в работе антитела, иолекулярно-генетические конструкции
рекомбинантные белки, а также разработанные методические подходы и предложенные іеханизмьг действия изученных белков, могут быть использованы для широкого спектра сследований в области мышечного сокращения и клеточной подвижности.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Іссроссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и ладких мышц", (Пущпно, Россия, 1996), на 2-ом, 3-ем и 4-ом совещаниях стипендиатов Іедицішского Института Говарда Хьюза (Варшава, Польша, 1997; Москва, Россия, 1499), на іеждународном симпозиуме "Биологическая подвижность: современные методы сследования" (Пущино, Россия, 1998), па 37-ом конгрессе Американского Клеточно-иологнческого общества (Вашингтон, США, 1997), на 27-ой и 28-ой Европейских мышечных онференцпях (Лунд, Швеция, 1998, Йорк, Великобритания, 1999).
Публикации. По данным работы опубликовано 4 статьи и 14 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 границах машинописного текста, включает 34 рисунка и 1 таблицу, состоит из введения, бзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, ыводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 154 источника.