Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблема симбнотической фиксации атмосферного азота бобовыми растениями привлекает внимание большого числа исследователей во всем мире. Она важна не только с точки зрения фундаментальной науки, но и представляет исключительное практическое значение. Процесс азотфиксации важен и как один из источников пищевого и кормового белка, и для поддержания плодородия почв, причем без ухудшения экологической обстановки.
Симбиотическая система бобового растения включает в себя само растение-хозяина и клубеньковые бактерии родов Rhizobium и Bradyrhizobium. Эти бактерии находятся в клубеньках бобовых растений в виде бактероидов, в которых и проходит сам процесс фиксации азота. Для нормального протекания этого процесса в клубеньках в целом и в инфицированных клетках, где содержатся бактероиды, должны поддерживаться определенные условия. Чрезвычайно важным является поддержание оптимального кислородного режима, поскольку, с одной стороны, нитрогеназа - фермент, катализирующий реакцию связывания азота, ингибируется свободным кислородом, а, с другой, кислород необходим для метаболизма самих бактероидов.
Было известно, что донором связанного кислорода для бактероидов является легоглобин (леггемоглобин) - миоглобинподобиый кислородпереносящий гемопротеид клубеньков. Было изучено строение легоглобина, известны многие его свойства. Также известно, что первым этапом регуляции кислородного режима в клубеньках является барьер газовой диффузии в коре, после прохождения которого концентрация кислорода резко снижается.
Однако к началу наших исследований многое в этой проблеме оставалось
Сокращения, использованные в работе: Lb - легоглобин, Lb2*, Lb3+, ІЬ02 -восстановленная, окисленная и оксигенированная формы легоглобина, мет-Lb-редуктаза - метлегоглобинредуктаза, FOL - доля оксигенириванного легоглобина, Ое, Os, Oi - концентрация кислорода вне клубенька, в межклеточных газовых пространствах и в инфицированной клетке соответственно.
невыясненным. Хотя в лаб. чл.-корр. РАН В.Л.Кретовича в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН было показано существование процесса ферментативного восстановления легоглобина, этот процесс, необходимый для поддержания легоглобина в физиологически активном состоянии, не был изучен. Не было исследовано взаимодействие процессов с участием легоглобина. Не были окончательно выяснены и кислородные условия в самой инфицированной клетке. В связи с этим не были ясны вклад инфицированных клеток в регуляцию кислородного режима в клубеньке по сравнению с кортикальным % барьером диффузии и, соответственно, общая схема такой регуляции.
Цель и задачи работы.
Основной целью работы было изучение функционирования легоглобина, механизмов, поддерживающих его в физиологически активном состоянии, его роли в регуляции кислородных условий в инфицированной клетке, и, на основании полученных данных, всей системы регуляции кислородного режима в клубеньке.
В связи с эгим в работе были поставлены следующие задачи:
-
изучить процесс ферментативного востановления легоглобина, необходимый для его поддержания в физиологически активном состоянии, и метлегоглобинредуктазу -фермент, катализирующий этот процесс,
-
изучить взаимосвязь между процессами, в которых участвует легоглобин в клубеньке и которые необходимы для его нормального функционирования: восстановление, окисление, оксигенация, деоксигенация,
3) изучить кислоподный статус инфицированной клетки с учетом
функционирующего в ней легоглобина и участие самой этой клетки в регуляции
кислородных условий,
4) выяснить вклад различных этапов (барьер газовой диффузии ". коре и
инфицированная клеї..а) в общую регуляцию кислородного режима в клубеньке,
дать описание системы такой регуляции с учетом полученных данных.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Изучен процесс ферментативного восстановления легоглобина і клубеньках бобовых. Впервые получен гомогенный препарат мстлегоглобинредуктазы цитозоля ь.чубеш.ко» люпина. Изучены свойства фермента. Пыли также изучены свойства та'іонічного фермента н:і клубеньков сон. Установлено, что мет-Lb-ргдуктаза
является белком растительного происхождения, но не является нодулином. Похазано, что ферментативное восстановление Lb является в клубеньках основным.
Изучено взаимодействие различных процессов с участием легоглобина. Проведено сравнение процессов восстановления легоглобина 'в анаэробных и аэробных условиях, показано, что легоглобин может восстанавливаться в обоих случаях. Изучена роль легоглобина как донора кислорода в опытах с бактероидами in vitro. Впервые описан процесс спонтанной деоксигенации легоглобина, выдвинута гипотеза о возможной роли этого процесса в клубеньках. Предложена схема функционирования легоглобина в клубеньках, учитывающая различные процессы с его участием и различные пути протекания этих процессов.
Проведено изучение фермента, обладающих мет-ЬЬ-редуктазной активностью, из бактерий и бактероидов Bradyrhizobium lupini. Впервые получен гомогенный препарат этого фермента, изучены его свойства. Показано наличие аналогичных редуктаз и в некоторых других бактериях.
Впервые проведена экспрессия легоглобина (Lb I люпина) в клетках Е. coli.
Получен гем-содержащий физиологически активный легоглобин. n
Изучено сродство легоглобина к кислороду в физиологическом диапазоне температур (15-25С). Показано, что данные оксиметрии по влиянию температ оы на долю окснгенировакиого LbC>2 и на концентрацию кислорода в инфицированной клетке согласуются с данными о сродстве легоглобина к кислороду.
С использованием метода оксиметрии и с помощью математического моделирования изучен кислородный статус инфицированной клетки клубенька. Подтверждена гипотеза, что понижение концентрации кислорода происходит и во внешней зоне самой инфицированной клетки. Проведено моделирование ситуации в целом клубеньке с одновременным учетом роли как кортикального барьера газовой диффузии, так и самой инфицированной клетки. Рассчитан вклад обоих этих этапов в общую регуляцию кислородного режима в клубеньке.
Полученные данные позволили предложить схему регуляции КНСЛО^ /ДНОГО режима в клубеньках бобовых с учетом ее различных этапов. Показано, что в такой регуляции принимает участие как барьер газовой диффузии в коре клубенька, так и сама инфицированная клетка. Тем самым показана роль легоглобина не только как донора связанного кислорода для бактероидов, но и как важной составной чачи системы регуляции кислородного режима в инфицированной клетке.
.-4
Полученные данные существенно расширяют знания о ситуации в инфицированной клетке .и в целом клубеньке, позволяют полнее представить, как в клубеньках происходит поддержание кислородных условий, необходимых для оптимального протекания процесса симбиотической азотфиксации.
В ходе исследований разработаны методики очистки как метлегоглобинредуктаэы цитозоля клубеньков люпина, так и редуктаз из других объектов, которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях. Полученный штамм Е. соН может быть использован для получения препарата легоглобина I люпина. Данные о сродстве легоглобина к кислороду при различных температурах и другие связанные с этим данные, могут быть использованы как для расчета экспериментальных данных, так и для использования в математических моделях, описывающих инфицированную клетку и клубенек в целом.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены более чем на 30 научных конференциях и симпозиумах, в том числе на VI (Чернигов, 1980), VII (Тбилиси, 1983), VIII (Кобулети, 1988) и IX (Москва, 1995) Баховских Коллоквиумах по азотфиксации, на IV (Ленинград, 1979) и V (Киев, 1986) Всесоюзных биохимических съездах, на II Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), на III Международном молодежном симпозиуме по физиологии растительной клетки (Варна, Болгария, 1983), на XVI конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Москва, 1984), на V Международном люпиновом конгрессе (Познань, Г >льша, 1988), на VII Восточно-европейской конференциях по азотфиксации (Бендлево, Польша, 1990), на Восточно-Канадской конференции физиологов растений (Кингстон, Канада, 1993), на Гордоновской конференции ло кислородпсрсиосящим белкам (Плимут, Нью-Гемпшир, США, 199/), на X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 199S).
Работа отмечена бронзовой медалью ВДНХ в 1987 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 64 печатных работы. .
Структура и объем диссертации,