Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 16
1.1. Монооксид азота 16
1.1.1. Биосинтез монооксида азота 16
1.1.2. Биологические эффекты монооксида азота 17
1.1.3. Методы определения монооксида азота 19
1.1.4. Доноры монооксида азота 24
1.2. Органические нитраты 31
1.2.1. Пути биотрансформации органических нитратов 31
1.2.2. Абсолютная необходимость тиолов и толерантность 35
1.3. Гемоглобин 38
1.3.1. Структура и свойства гемоглобина 38
1.3.2. Конформационные состояния гемоглобина 41
1.3.3. Взаимодействие гемоглобина с GTN 43
1.3.4. Свойства гемоглобина как нитритредуктазы 44
1.3.5. Диоксигенация и нитрозилирование гемоглобина 48
1.3.6. Гипотеза сохранения активности монооксида азота в организме через образование S-нитрозогемоглобина 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 52
ГЛАВА 3. Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров N0 58
3.1 Разработка методики определения монооксида азота 58
3.2. Использование гемоглобина в качестве индикатора NO-донорной
способности железонитрозильных комплексов в протонных средах 61
ГЛАВА 4. Гемоглобин как редуктаза в реакциях с органическими нитратами 75
4.1 Кинетика образования нитрит-иона в системе «нитрат- восстановитель» 75
4.2. Кинетика образования монооксида азота в системе «нитрат-цистеин-гемоглобин» 82
Выводы 93
Список литературы 94
- Монооксид азота
- Биологические эффекты монооксида азота
- Разработка методики определения монооксида азота
- Кинетика образования нитрит-иона в системе «нитрат- восстановитель»
Введение к работе
Многообразие биологических эффектов монооксида азота (N0) можно разделить на три типа: регуляторное, защитное и повреждающее. Уникальные свойства N0 проявляются во всех аспектах функционирования живого организма - от регулирования нейротрансмиссии и иммунитета до ингибирования агрегации тромбоцитов и их адгезии на стенках кровеносных сосудов. Эти свойства стали предметом интересов многих ученых и породили огромную волну исследований в биологии и химии монооксида азота.
Данные о многофункциональной биологической активности NO in vivo используются при разработке фундаментальных основ создания нового поколения лекарственных препаратов, в первую очередь применяемых в терапии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Практически все используемые в медицине препараты такого спектра действия (к ним не относятся, например, NO-стимуляторы) представляют собой экзогенные источники или доноры N0, из которых монооксид азота может высвобождаться по механизмам различных типов.
Ярким предметом регуляторного действия N0 является его вазодилата-торная активность. Сосудорасширяющее действие N0 связано с активацией растворимой формы фермента гуанилатциклазы. Как и все остальные физиологические эффекты N0, вазодилатация проявляется при очень низких, почти исчезающих концентрациях монооксида азота. А его чрезвычайно высокая ре-акционоспособность (время полужизни 2-5 с in vivo), затрудняет его определение. Обычно для детектирования N0 используются три основных метода: электрохимический, люминесцентный и метод ЭПР. Все они относятся к методам прямого определения N0. Но у каждого из них есть свои недостатки, не позволяющие применять их в кинетических исследованиях. Кроме этих трех, существует еще множество косвенных методов, но все они в основном обладают низкой чувствительностью. Их применение сопряжено со сложной про-боподготовкой и с большим числом мешающих компонентов.
Органические нитраты - это наиболее известный класс вазодилататоров - представляют собой экзогенные доноры N0. В процессе биотрансформации нитроэфиры в результате восстановления образуют N02 ~, а затем N0. Образование нитрит-иона из органических нитратов может происходить под действием восстановителей, например тиолов. Интересен тот факт, что в отсутствие или при истощении запасов внутриклеточных тиолов наблюдается толерантность - снижение эффективности действия при повторных применениях. Кроме того, скорость образования нитрит-иона из нитратов под действием цис-теина коррелирует с их вазодилататорной активностью. Помимо этого факта накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что NO2 ~, присутствующий в крови в концентрации 3-Ю"7 моль-л'1, представляет собой самую большую форму хранения N0 в организме.
Далее нитрит-ион превращается в N0 путём реакции с восстановителями, например, различными гемсодержащими белками, ксантиноксидоредукта-зой, а также тиол-содержащими ферментами. Недавно была показана нитрит-редуктазная активность гемоглобина - белка, выполняющего функцию переноса кислорода. При этом максимальная скорость взаимодействия его с нитритом наблюдается в условиях гипоксии - при 50%-ном насыщении кислородом. Без сомнения гемоглобин является самым распространенным восстановителем нитрита, поскольку его концентрация (свободного и эритроцитарного) составляет ~ 12-10"3 моль-л"1.
В отличие от органических нитратов и других синтетических N0-доноров (органических и неорганических) нитрозильные железосерные комплексы генерируют N0 без применения дополнительных активаторов - в результате гидролиза в протонной среде. Кроме того, что эти соединения могут выступать в роли «депо» эндогенного и экзогенного N0 (за счет реакций транснитрозилирования), они также являются удобным инструментом для исследований. В реакциях с НЬ эти соединения образуют нитрозилированный по железу комплекс HbNO, устойчивость которого зависит от концентрации кислорода in vivo.
Как становится ясно, роль гемоглобина в организме не ограничивается только функцией переноса кислорода. В последнее десятилетие активно разрабатывается гипотеза, что гемоглобин в составе эритроцитов является одним из важнейших элементов системы биологической трансформации доноров N0 и транспортировки N0 внутри организма. Но это предположение остается до конца не выясненным, оставляя поле деятельности для будущих исследований.
Монооксид азота
В конце 70-х годов XX века появились сенсационные публикации, в которых было описано изучение производимого эндотелием фактора релаксации сосудов (EDRF) и представлены однозначные доказательства того, что, этот фактор есть не что иное, как монооксид азота (N0) [1,2]. Журнал «Science» в 1992 году назвал N0 молекулой года. А в 1998 году группа ученых из США (Murad, Furchgott, Ignarro) была удостоена Нобелевской премии по физиологии и медицине за изучение сосудистых эффектов N0. Эти открытия породили огромную волну исследований в биологии и химии монооксида азота. К настоящему времени насчитывается уже тысячи публикаций, посвященных N0. Появился даже одноименный журнал. Следует отметить, что в настоящее время существует мнение о том, что EDRF и N0 не полностью идентичны, а что EDRF представляет собой некое нитрозосоединение, точная структура которого пока не установлена [3].
Биосинтез монооксида азота
Основной способ образования NO in vivo - из аминокислоты L-аргинина (Arg). Синтез монооксида азота катализируется группой металло-ферментов - NO-синтаз (NOS), достаточно селективных по своему субстрату. NO-синтазы окисляют аминогруппу в гуанидиновом остатке Arg (Схема 1), в Схема 1. Образование монооксида азота in vivo. На образование одной молекулы N0 затрачивается одна молекула Arg, которая восполняется в цикле мочевины. результате чего высвобождается NO, a Arg превращается в цитруллин [4]. Цитруллин затем вновь восстанавливается в цикле мочевины до Arg, пополняя внутриклеточные запасы [5]:
Для активности NOS необходимо 6 кофакторов: ионы кальция, тиол-связанный гем, ионы цинка, кальмодулин, NADPH и тетрагидробиоптерин (ВН ). Без ВН4 продукция N0 полностью прекращается и NOS начинает синтезировать только супероксид-анион (02_) [1,6].
Были идентифицированы три изо-формы NO-синтаз: эндотелиальная (eNOS) - генерирует N0 в эндотелии кровяных сосудов; нейрональная (nNOS) - присутствует в мозговых нейронах и синтезирует N0, действующий как нейротрансмиттер (химический передатчик сигнала нейронов); индуцибельная (iNOS) - синтезируется в макрофагах в ответ на бактериальные и вирусные инфекции [7].
Синтез N0 с участием различных форм NOS является доминирующим, но не единственным путем его генерации in vivo. В литературе описаны несколько NOS-независимых путей образования N0. Среди них можно указать биотрансформацию нитрита в N0 под действием гемоглобина [8], реакцию между аргинином и Н202 с образованием N0 [9] и катализируемое ксантинок-сидазой восстановление NCV в N0 [10]. Реализация этих механизмов особенно целесообразна в условиях острого дефицита кислорода и энергии, поскольку активация NO-синтазных систем в таких экстремальных условиях может оказаться слишком дорогим в структурном и энергетическом отношении способом получения монооксида азота. Это имеет место при гипоксии, функциональной нагрузке, а также при развитии патологических процессов в их острой фазе, например ишемии мозга и сердца.
Биологические эффекты монооксида азота Физиологические эффекты N0 проявляются при очень низких, почти исчезающих концентрациях этого чрезвычайно активного радикала (ЕС5о 1-5 нМ [8]). За счет низкой молекулярной массы и высокой липофильности N0 обладает высокой диффузионной способностью, что позволяет ему оказывать влияние не только на клетки, которые его продуцируют, но и на клетки, находящиеся на определенном отдалении от места его синтеза. Все многообразие биологических эффектов N0 можно разделить на три типа:
1. Регуляторное влияние N0 на сосудистый тонус, адгезию клеток, проницаемость сосудов, нейротрансмиссию, бронходилатацию, агрегацию тромбоцитов.
2. Защитное действие N0 проявляется в его антиоксидантной активности, ингибировании адгезии лейкоцитов, цитолитическом и цитостатическом действии на чужеродные, в том числе, раковые клетки.
3. Повреждающее действие N0, выражающееся в ингибировании ряда ферментов, нарушении структуры ДНК, индукции процессов перекисного окисления липидов, снижении антиоксидантного потенциала клеток, повышении их чувствительности к радиации, алкилирующим агентам и токсичным ионам металлов.
Ярким примером прямого регуляторного действия N0 служит его вазо-дилататорная активность. Сосудорасширяющее действие N0 связано с активацией растворимой формы фермента гуанилатциклазы (sGCase) [11]. sGCase катализирует биосинтез циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (cGMP) из гуа-нозинтрифосфата. Как известно, cGMP оказывает модуляторное действие на многие клеточные процессы [12]. Характерной особенностью sGCase является наличие в ней гемовой группы. N0 связывается с железом гема и специфично изменяет его структуру [11]. Такие конформационные перестройки приводят к резкому возрастанию активности sGCase (до 400-кратного) и накоплению cGMP.
В процессе вазодилатации, кроме cGMP, участвуют cGMP-зависимая протеинкиназа, Са -АТР-аза и ионы Са [13]: накопление cGMP в клетках ак 94 тивирует cGMP-зависимую протеинкиназу и Са -АТР-азу. Первый фермент может фосфорилировать ряд белков, в том числе NOS, что приводит к повышению синтеза N0 [14]. Тем самым осуществляется регулирование синтеза N0 по механизму отрицательной обратной связи. Са -АТР-аза участвует в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу Са2+ из гладкомышечных клеток и снижению его способности вызывать мышечное сокращение [13]. Благодаря этому происходит расслабление гладких мышц и вазодилатация.
Биологические эффекты монооксида азота
Все более растущий интерес исследователей к этой молекуле требует точных качественных и количественных методов детектирования N0. Трудности в определении N0 связаны в основном со следующими факторами.
Время полужизни N0 порядка 2-5 с in vivo. [15]. Это означает, что стационарные концентрации N0 в организме невелики. Поэтому достигнуть точного измерения NO in vivo достаточно сложно.
Поскольку N0 является свободным радикалом, повреждение организма, наносимое им, усиливается за счет присутствия свободных радикалов (гидро-кси-радикал (ОН ), супероксид-анион (Ог " )), окислителей (перекись водорода и молекулярный кислород), антиоксидантов (аскорбиновая кислота, Cys, NADH, NADPH и GSH); ферментов или белков (супероксиддисмутаза (SOD), каталаза, гемоглобин и цитохром С), непосредственно ионов металлов (Fe , Fe3+, Cu2+, Са2+). Все эти соединения присутствуют в живых организмах и способны прямо или косвенно реагировать с N0, образуя другие не мене активные NO-производные соединения, которые, в конечном счете, значительно усложняют определение.
N0 является сигнальной молекулой, и эффекты вызываемые им, также могут быть вызваны и другими нейротрансмиттерами, такими как ацетилхо-лин или допамин [16]. Поэтому при использовании косвенных методов, сложно отделить вклад N0 от вклада других соединений.
Обычно для детектирования N0 используются три основных метода: электрохимический, люминесцентный и метод ЭПР. Это методы прямого определения N0 (за исключением люминол-пероксидной реакции). Другие методы являются косвенными и основаны на определении NO-производных, образующихся в процессе метаболизма [17].
Электрохимический метод
В основе большинства электродных сенсоров лежат процессы электроокисления N0, поскольку мешающим фактором электровосстановления является молекулярный кислород. Электроокислительные сенсоры делятся на электроды измерения прямого и каталитического электроокисления [18]. На рынке представлен ряд коммерческих электродов, но по причине высокой стоимости они не всегда являются доступными. Существуют методики [19], следуя которым можно сконструировать некоторые из них в лабораторных условиях.
Электрохимический метод обладает рядом таких достоинств, как высокая чувствительность, простота пробоподготовки, экспрессность. В портативном исполнении существует возможность использования in situ [20]. Недостатки метода - сложность калибровки, жесткая зависимость от температуры и высокая стоимость (требуется постоянная замена электродов). Кроме этого количественный электрохимический метод не пригоден для длительных кинетических измерений, так как используемый при этом NO-сенсорный электрод поляризуется во времени и требует постоянной регенерации.
Хемилюминесцентный метод
Для реализации люминесцентных методов необходимо возникновение энергетически возбужденного состояния с последующим его переходом в энергетически невозбужденное состояние с испусканием светового кванта [21]. Источником возбуждения при хемилюминесцентном определении монооксида азота служит реакция окисления N0 озоном или перекисью водорода.
В реакции N0 с озоном продуктом является диоксид азота N02 , который испускает фотон и переходит в основное состояние: NO+03- NO 2+02, N02 N02+light(hv). Такой метод прямого измерения N0 является достаточно быстрым и достоверным, обладает высокой чувствительностью, но может быть применим только для детектирования N0 в газовой фазе. Вследствие этого метод не может быть использован для мониторинга in vivo, который обычно включает водные растворы. Кроме того, метод подвержен сильным помехам и его воспроизводимость сильно зависит от потока озона, который довольно трудно контролировать [17].
Взаимодействие N0 с перекисью водорода идет с образованием перок-синитрита (ONOCT), более сильного окислителя, чем Н202. Определение N0 таким способом является косвенным, так как сигнал образуется за счет реакции люминола (Хвдзб = 350 нм, ах = 450 нм) с пероксинитритом [17]: Н202 +N0 0N00 + 2Н+, 0N00 + iuminol -»light(hv).
Люминол-пероксидная система довольно специфична для N0 [22]. Но селективность метода сильно зависит от присутствия восстановителей. Другие азотсодержащие соединения (органические нитриты, органические нитраты, S-нитрозосоединения) не являются мешающими компонентами. Метод характеризуется высокой чувствительностью, применим в водных растворах, что позволяет определять N0 в биологических образцах. В целом это хороший, чувствительный, но качественный метод.
Метод электронного парамагнитного резонанса N0 может реагировать с целым рядом межклеточных гемовых и неге-мовых мишеней с образованием ЭПР-активных нитрозильных комплексов, что позволяет применять его in vivo. Например, детектирование динитрозильных железосерных комплексов в живых клетках и тканях [23]. Как и для всех радикалов, наблюдаемый сигнал состоит из g м=2,02 и gi=2,04 со сверхтонкой структурой по осевой симметрии (замороженные образцы) или из изотропного триплета gav=2,03 (жидкие образцы при 37 С). В качестве зондов для определения N0 используют гемовые и негемовые соединения, дитиокарбоматы (Ы -диэтил дитиокарбомат (DETC), N-метил D-глюкамин дитиокарбомат (MGD), [Fe(DETC)2]), нитронилнитроксиды (2-фенил-4,4,5,5 тетраметилимидазолин-1-окси 3-оксид (РТЮ) и его производные), 3,5-дибромобензенсульфонат (DBBS) [24,25, 26].
Метод ЭПР может быть использован для подсчета коэффициента диффузии N0 в биологических мембранах [27]. ЭПР также обеспечивает количественные измерения образования N0, используя стандартные сигналы с коммерчески доступными зондами. В целом метод ЭПР может обеспечить адекватную чувствительность и селективность и может быть использован как для прямого, так и для косвенного определения NO in vivo (но не in situ). Но в большинстве случаев метод ограничивается дороговизной и доступностью оборудования, длительностью пробоподготовки, сложностью проведения анализа и интерпретацией результатов.
Разработка методики определения монооксида азота
Известно, что НЬ при взаимодействии с N0 образует комплекс HbNO. При этом образующийся продукт имеет характерный спектр поглощения. Пик поглощения НЬ при образовании HbNO расщепляется на два: Хтах = 545 нм (є = 12.6 ммоль л-см"1) и Хтах = 575 нм (є = 13.0 ммоль -л-см 1), в расчете на один гем для НЬ человека [71]. Поэтому НЬ, который в данной работе являлся компонентом реакционной системы, был использован для регистрации кинетики образования N0 по накоплению HbNO. На рисунке 3 приведены спектры НЬ и HbNO.
Известно, что константа равновесия реакции комплексообразования N0 с гемами Hb имеет величину 3-Ю10 моль л [71]. Это позволяет использовать НЬ в качестве «ловушки» N0.
Поскольку исходный спектр и спектр образующегося продукта лежат в одной аналитической области, то в процессе преобразования НЬ в HbNO происходит наложение спектров. В связи с этим концентрацию HbNO по спектру поглощения реакционной системы, содержащей НЬ и HbNO, оценивали путем декомпозиции экспериментальных спектров поглощения на индивидуальные составляющие (НЬ и HbNO), используя метод наименьших квадратов. При этом искомая степень конверсии НЬ в HbNO (х) будет удовлетворять минимуму функционала c(x)=JjA(Xi)-((i-x)AHb(ll)+xAmm(ki))]2, где: А - поглощение ис следуемого раствора при длине волны А,,-; Ань и Атт - поглощение растворов НЬ и HbNO при длине волны Xh соответственно. Расчет х проводился в диапазоне длин волн 450-650 нм по двумстам экспериментальным точкам. Найденные минимальные значения среднеквадратичного отклонения a(x)/(N-l), где N- число экспериментальных точек, во всей серии экспериментов находились в интервале 10"5 - 10"6. Это говорит о высоком качестве моделирования спектра поглощения реакционной системы в каждый момент времени и о точности определения концентраций НЬ и HbNO. При наличии в системе metHb (о чём свидетельствует поглощение с максимумом при щах = 631 нм) подобным образом проводили разложение спектра на три составляющих.
Спектрофотометрический метод с использованием гемоглобина для определения N0 является более универсальным, по сравнению с другими методами, описанными в главе «Литературный обзор». Кроме того, он дает возможность проводить длительные кинетические измерения, что не позволяют делать другие методы. В отличие от оксигемоглобинового (или метгемоглоби-нового) метода [116], в условиях полной анаэробности продукт, образующийся в ходе реакции, имеет высокий коэффициент экстинкции и идентифицируется однозначно, как результат взаимодействия НЬ с монооксидом азота. Высокая селективность метода в совокупности со скоростями образования аналитической формы определяемого N0, делают метод неподверженным влиянию мешающих компонентов. Недостатком метода являются наличие соединений, поглощающих в аналитической (X = 450-650 нм) области. Это устраняется с помощью техники записи разностных спектров - в кювету сравнения помещается раствор с поглощающей компонентой соответствующей концентрации.
При работе необходимо подбирать исходную концентрацию НЬ таким образом, чтобы он был в эквимолярных соотношениях с определяемым N0. Иначе, если количество N0 будет составлять менее 10% от количества НЬ, то однозначно судить о его наличии будет нельзя. В случае кинетических измерений эта проблема легко решается, так как в большинстве случаев реакции проходят до конца, а точность определения зависит только от точности метода наименьших квадратов. Сложность проведения анализа связана также с достижением условий полной анаэробности, так как присутствие кислорода делает этот метод непригодным для определения N0. Известно, что N0 быстро взаимодействует с СЬ, давая оксиды азота с более высокой степенью окисле (\ 1 "У 1 ния (константа скорости реакции к = 2-Ю (моль -л) -с") [30].
Выбор НЬ для анализа эффективности доноров N0 представляет также и научный интерес, поскольку, как уже говорилось выше, метаболизм N0 в организме в значительной мере связан с образованием нитрозилированного по железу комплекса НЬ в эритроцитах [96]. Поддержание тонуса сосудов, как было показано, определяется образованием N0 и HbNO в результате нитрит-редуктазной активности дезоксигемоглобина и дезоксигенированных эритроцитов. На основании этого была высказана гипотеза, что гемоглобин в составе эритроцитов может являться одним из важнейших элементов системы биологической трансформации доноров N0 и транспортировки монооксида азота внутри организма. Кроме того, N0 может образовывать стабильные S-нитрозотиолы с SH-группами гемоглобина. Таким образом, клетка эритроцита превращается в «депо» относительно стабильных доноров N0.
Кинетика образования нитрит-иона в системе «нитрат- восстановитель»
Имеются данные [51, 65], свидетельствующие о том, что скорость образования нитрит-иона из органических нитратов коррелирует с их вазодилататорной активностью (Рис. 14). (HL2-M IS-2-HM
Рис. 14. Логарифм константы скорости второго порядка (моль -л-ч"), отложенный от логарифма концентрации органического нитрата (ммоль-л"1), требуемого для 50%-ного увеличения коронарного тока в сердце по методу Лангендорфа. R = 0.985, исключая IS-5-MN. G-l,2-D - 1,2-динитроглицерин; G-1,3-DN - 1,3-динитроглицерин; G-1-N- 1-нитроглицерин; IS-2-MN - изосорбид-2-мононитрат.
Поэтому достаточно иметь надёжный метод анализа скорости образования нитрит-иона из органических нитратов, чтобы судить об их эффективности как вазодилататоров.
Ранее было описано взаимодействие производных GTN и ISDN с Cys с образованием нитрит-иона [51]. Но механизм этой реакции не был изучен. Реакция была записана авторами, как взаимодействие молекулы Cys с нитратом. Данные о зависимости скорости реакции от рН свидетельствующие о том, что с тионитратом реагирует тиолат-ион R S", позволяют объяснить различную реакционную способность моно-, ди- и тринитропроизводных глицерина с Cys [51]. Известно, что отрицательный индукционный эффект нитрогрупп ведет к перераспределению электронной плотности в пределах одной молекулы. Это увеличивает их реакционную способность. Чем больше нитрогрупп в молекуле, тем сильнее этот эффект. Поэтому реакционная способность GTN выше, чем у его моно- и динитроаналога.
На модельной системе «нитрат-цистеин» было проведено сравнение эффективностей ряда органических нитратов (3 10" моль-л") в реакции с Cys (10 2 моль-л"1). Полученные данные представлены в таблице 5. скольку метальная группа обладает положительным индукционным эффектом, в то время как у оксетановой группы индукционный эффект отрицательный. Для соединения MPDD, которое имеет две электронно-акцепторные ОН группы активность больше. Самая высокая активность наблюдалась в случае GTN.
Величина частичного положительного заряда на атоме азота при 0-N связи в нитроэфирах зависит от индукционного эффекта остальной части молекулы. А поскольку R S" является нуклеофилом, то снижение активности в ряду вышеперечисленных соединений связано, скорее всего, с количеством нитрогрупп и пространственной структурой молекулы.
Далее на примере NMO была исследована кинетика взаимодействия органических нитратов с Cys по скорости образования NC - при различных концентрациях реагентов (Рис. 17). Концентрацию нитрит-иона определяли по реакции Грисса [115].
Реакция NMO с Cys может осуществляться двумя способами - либо в одну стадию как тримолекулярная, либо как последовательность двух элементарных бимолекулярных стадий.
Было проведено кинетическое моделирование для первого случая, когда реакция идет в одну стадию (здесь и далее: RONO2 - NMO, R SH - цисте-ин): RON02 + IR SH - NO; + ROH +R S-SR + H+,
Были получены теоретические кривые для одностадийного тримолеку лярного механизма (Рис. 17а). Как видно из иллюстрации, в этом случае соот ветствия не наблюдается. Так как тримолекулярные реакции редки, то полу ченный результат является ожидаемым. Поэтому реакция NMO с Cys была рассмотрена как последовательность двух бимолекулярных стадий [120]: NMO реагирует с Cys с образованием тионитрата RS-N02 , который далее восста навливается
Похожие диссертации на Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO и редуктаза в модельных NO-генерирующих системах in vitro
