Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
Кислород: дыхание и активные формы кислорода (АФК) 7
Кислород и продукты его восстановления 7
Восстановление кислорода до воды в митохондриях 10
Продукты неполного восстановления кислорода 12
Генерация АФК митохондриями 15
Способы изучения генерации АФК митохондриями 16
Объекты исследований 16
Методы регистрации АФК 18
Источники АФК в митохондриях 20
Дыхательные комплексы I-III 20
Другие митохондриальные ферменты 26
Дигидролипоилдегидрогеназа 29
Локализация и функция 29
Структура 31
Редокс-состояния 34
КАБНілипоамид-оксидоредуктазная активность 35
NADH-зависимое востановление других акцепторов электронов 38
Липоамидредуктазная и диафоразная активности - сходства и различия... 39
Генерация АФК 42
Другие активности 43
Антиоксидантные системы в митохондриях 44
АФК - роль в физиологии и патологии 47
Предпосылки настоящего исследования 49
Материалы и методы исследования 51
Материалы 51
Препаративные методы 51
Получение митохондрий сердца крысы 51
Получение митохондрий сердца быка 52
Получение белковой фракции матрикса 53
Получение субмитохондриальных частиц 53
Получение аммоний-чувствительной КАБНЮг-оксидоредуктазы из фракции митохондриального матрикса 54
Получение рекомбинантной ДЛДГ человека 55
Получение препарата а-кетоглутарат- и пируватдегидрогеназного комплексов57
Получение восстановленного липоамида 58
Аналитические методы 59
Определение скорости генерации перекиси водорода 59
Определение скорости генерации перекиси водорода пермеабилизованными митохондриями 60
Определение скорости генерации перекиси водорода амперометрическим методом 62
Определение скорости генерации супероксид-радикала 63
Определение трансгидрогеназной активности 64 Определение NADH: липоамид оксидоредуктазной активности 64
Определение скорости дыхания митохондрий 65
Определение активности а-кетоглутарат- и пируват-дегидрогеназных комплексов 65
МАЛДИ-масс спектрометрический анализ 66
Электрофорез по методу Лэммли 66
Определение концентрации белка 66
Статистическая обработка данных 67
Результаты 68
Получение очищенного препарата КАБНОг-оксидоредуктазы из митохондриального матрикса 68
Идентификация аммоний-чувствительной NADH: О2-оксидоредуктазы из митохондриального матрикса 68
Кинетические параметры ДЛДГ в реакции генерации перекиси водорода 71
Генерация перекиси водорода ДЛДГ в составе -кетоглутарат- и пируватдегидрогеназного комплексов 76
Генерация перекиси водорода интактными митохондриями 79
Генерация перекиси водорода пермеабилизованными митохондриями 82
Проницаемость митохондриальной мембраны для перекиси водорода 83
Распределение Н2О2-генерирующих активностей между мембранной и растворимой фракциями митохондрий 85
Зависимость генерации Н2О2 от концентрации и соотношения NAD+/NADH 87
Зависимость скорости генерации перекиси водорода ДЛДГ от концентрации кислорода 89
Механизм NADH: 02-оксидоредуктазной реакции, катализируемой ДЛДГ 92
Обсуждение результатов 94
NADH-зависимые генераторы АФК в матриксе митохондрий 94
Локализация ДЛДГ в митохондриях 94
Ограниченная проницаемость внутренней мембраны митохондрий для перекиси водорода 96
Дыхание и продукция АФК митохондриями - сравнение потоков электронов 97
Вклад ДЛДГ в продукцию АФК митохондриями 99
Зависимость генерации АФК комплексом I и ДЛДГ от концентрации NADH... 100
Влияние соотношения NAD+/NADH на генерацию АФК митохондриями 102
Зависимость генерации АФК митохондриями от концентрации кислорода 104
Стимуляция продукции АФК ионами аммония 106
Специфичность эффекта ионов аммония 106
Механизм активирующего влияния аммония на генерацию перекиси водорода ДЛДГ 108
О возможной роли ДЛДГ в продукции АФК в физиологических и патологических условиях 109
Выводы 113
Список цитируемой литературы
- Кислород и продукты его восстановления
- Способы изучения генерации АФК митохондриями
- Получение аммоний-чувствительной КАБНЮг-оксидоредуктазы из фракции митохондриального матрикса
- Дыхание и продукция АФК митохондриями - сравнение потоков электронов
Введение к работе
Актуальность темы
Около 90% кислорода, потребляемого аэробными организмами, восстанавливается до воды. Из оставшейся части образуются продукты его неполного восстановления, так называемые активные формы кислорода (АФК1): супероксид-радикал, перекись водорода и гидроксил-радикал. Избыточное образование АФК при недостаточной активности антиоксидантных систем приводит к развитию окислительного стресса, который, в конечном счете, может приводить к гибели клеток. Нарушения баланса между образованием и утилизацией АФК в клетках (как в сторону накопления избыточного количества АФК, так и при их недостаточности) коррелируют с различными патологиями, включающими развитие рака, сердечнососудистых и нейродегенеративных заболеваний, катаракты.
Митохондрии вносят существенный, хотя и не основной, вклад в генерацию перекиси водорода в клетках (согласно грубой оценке для митохондрий печени – 15–20%). До недавнего времени считали, что основным источником АФК в митохондриях является дыхательная цепь, а точнее – комплекс I (NADH: убихинон-оксидоредуктаза).
В нашей группе традиционно изучают каталитические свойства комплекса I, и в 2008 году были получены данные, свидетельствующие о том, что в условиях, моделирующих физиологические, супероксид-генерирующая активность комплекса I сильно подавлена. Одновременно с этим было высказано и доказано предположение, что в митохондриальном матриксе существует фермент, способный обеспечивать высокую продукцию АФК в присутствии NADH как донора электронов. Кроме того, оказалось, что генерация перекиси водорода, обусловленная ферментом, локализованным в матриксе, сильно стимулируется ионами аммония.
Оставалось неизвестным, является ли фермент, обеспечивающий NADH-зависимое образование перекиси водорода, стимулируемое ионами аммония, ранее не известным, или это новая каталитическая активность уже известного белка матрикса.
Цель работы: идентифицировать фермент, катализирующий NADH-зависимую аммоний-стимулируемую генерацию перекиси водорода в матриксе митохондрий, охарактеризовать его кинетические свойства и изучить вклад этого фермента в суммарную генерацию перекиси водорода митохондриями.
1 Список использованных сокращений: АФК – активные формы кислорода, ДЛДГ – дигидролипоилдегидрогеназа, ПО – пероксидаза хрена, СМЧ – субмитохондриальные частицы, СОД – супероксиддисмутаза, ADP – аденозиндифосфат, FAD – флавинадениндинуклеотид, MALDI – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, NAD+/NADH – никотинадениндинуклеотид окисленный/восстановленный
Задачи работы: 1. Получить в гомогенном виде и идентифицировать фермент, катализирующий стимулируемое аммонием NADH-зависимое образование Н2О2 (NADH:О2-оксидоредуктазу). 2. Сравнить потоки электронов на кислород в реакциях одно-, двух- и четырехэлектронного восстановления в митохондриях. 3. Оценить вклад растворимых и мембранно-связанных ферментов в суммарную продукцию Н2О2 митохондриями. 4. Определить влияние суммарной концентрации и соотношения NAD+ и NADH на скорость продукции Н2О2 митохондриями. 5. Определить кинетические параметры реакции генерации Н2О2 под действием дигидролипоилдегидрогеназы (ДЛДГ).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Стимулируемая ионами аммония NADH-зависимая генерация перекиси водорода в митохондриях катализируется дигидролипоилдегидрогеназой (ДЛДГ).
-
Генерация перекиси водорода интактными митохондриями, окисляющими либо сукцинат, либо NAD-зависимые субстраты, сильно и специфично стимулируется ионами аммония.
-
Примерно половина продукции перекиси водорода митохондриями катализируется дыхательным комплексом I, а другая – ДЛДГ. В присутствии ионов аммония вклад ДЛДГ в суммарную продукцию АФК митохондриями возрастает до 90%.
-
Пермеабилизация митохондрий аламетицином увеличивает скорость образования АФК и стимулирует образование кислорода из добавленной извне перекиси водорода каталазой матрикса.
-
При физиологических значениях концентрации кислорода и соотношении NAD+/NADH в митохондриях скорость образования перекиси водорода комплексом I и ДЛДГ составляет не более 20% от максимальных значений, определяемых в оптимальных условиях in vitro.
Научная новизна
Установлено, что стимулируемая аммонием NADH-зависимая генерация перекиси водорода в митохондриях обусловлена активностью ДЛДГ. Образование перекиси водорода митохондриями сильно и специфично активируется ионами аммония, а вклад ДЛДГ в генерацию может составлять до 90%. Генерация перекиси водорода митохондриями в целом и ДЛДГ, в частности, сильно зависит от степени восстановленности нуклеотидов (NAD+/NADH). Скорость генерации перекиси водорода ДЛДГ линейно зависит от концентрации кислорода в области физиологических концентраций.
Практическая ценность
В результате работы показано, что дыхательная цепь митохондрий и, в частности, комплекс I не является основным источником активных форм кислорода в митохондриях, и в некоторых условиях его вклад не превышает 10%. В литературе существует множество данных о роли АФК в развитии различных патологий человека, включая рак и нейродегенеративные заболевания. В связи с этим в настоящее время разрабатываются
антиоксиданты с возможностью адресной доставки в митохондрии, призванные защищать клетки от окислительного стресса. Полученные в настоящей работе данные говорят о том, что следует обратить внимание на разработку лекарств, обладающих способностью накапливаться не только в мембранах митохондрий, но и в их матриксе. Кроме того, полученные в работе данные могут пролить свет на неизвестный до сих пор механизм токсического действия аммиака.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на Европейских конференциях по биоэнергетике (16 EBEC, Poland, Warsaw 2010 г., 17 EBEC, Germany, Freiburg, 2012 г.), на конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011 г.), на международной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013г.), на 2й международной конференции «Homo sapiens liberatus» (Москва, 2015 г.).
Публикации
Результаты работы опубликованы в 3 статьях и 2 тезисах научных докладов.
Структура и объем работы
Кислород и продукты его восстановления
Большинство из указанных трудностей легко преодолимо при использовании специфической пермеабилизации митохондриальных мембран. Обработка интактных митохондрий каналообразующим антибиотиком аламетицином приводит к образованию каналов во внутренней мембране, через которые свободно проходят низкомолекулярные соединения (в частности, NADH), а крупные молекулы (в частности, белки) остаются внутри митохондрий [25]. Таким образом, преимущество такого препарата перед интактными митохондриями состоит в устранении затруднений, связанных с проницаемостью мембраны, при сохранении естественного белкового окружения ферментов. Кроме того, использование пермеабилизованных митохондрий позволяет пренебрегать вкладом глутатион-зависимых антиоксидантов, так как при пермеабилизации глутатион выходит из митохондрий в среду измерения и его концентрация становится пренебрежимо мала. Основной недостаток пермеабилизации митохондрий – невозможность поддерживать потенциал на мембране, тогда как это одна из наиболее важных характеристик их состояния.
Субмитохондриальные частицы
При механической или ультразвуковой обработке митохондрий их внутренняя мембрана разрывается, а образовавшиеся фрагменты спонтанно замыкаются. 90% образующихся везикул (их называют субмитохондриальными частицами, СМЧ) имеют конфигурацию «inside-out», то есть наружной оказывается та сторона мембраны, которая в интактных митохондриях была обращена в сторону матрикса. Инвертированные субмитохондриальные частицы – достаточно удобный объект для изучения активности мембранных ферментов. Как и на пермеабилизованных митохондриях, для СМЧ отсутствует проблема доставки субстратов и высвобождения продуктов: активные центры ферментов обращены непосредственно в среду регистрации. Прочно сопряженные СМЧ способны поддерживать потенциал на мембране, что выгодно отличает их от пермеабилизованных митохондрий. Изолированные ферменты
Получение фермента в гомогенном виде – наиболее эффективный путь для определения его индивидуальных характеристик. Этот подход очень удобен для изучения механизмов образования АФК растворимыми ферментами. К сожалению методы очистки мембранносвязанных ферментов включают стадии жёсткой обработки (озвучивание, детергенты) и нельзя исключать их возможную модификацию в процессе выделения.
Супероксид, а особенно его протонированная форма, быстро самопроизвольно дисмутирует, что затрудняет его прямую регистрацию. Для регистрации супероксида используют несколько подходов, все они основаны на определении продуктов взаимодействия супероксида и различных соединений.
Метод спиновых ловушек основан на способности некоторых акцепторов взаимодействовать с супероксидом с образованием устойчивых радикальных аддуктов, которые могут быть зарегистрированы методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Разработаны спиновые ловушки, которые селективно поглощаются митохондриями. Однако у этого метода есть существенные недостатки: из-за низких скоростей взаимодействия необходимо использовать высокие концентрации (20-100 мМ) «ловушек», вызывающие токсическое воздействие на клетки или митохондрии. Кроме того, радикальные аддукты ловушек с супероксидом легко восстанавливаются под действием различных соединений (например, аскорбата). Совокупность недостатков делает этот метод малоприменимым для изучения более сложных систем, чем изолированные ферментные препараты.
Окисление некоторых соединений под действием супероксида (например, люцигенина) сопровождается хемилюменисценцией. Недостаток люцигенина состоит в том, что продукт его взаимодействия с супероксидом вступает в реакцию с кислородом. В результате образуется супероксид, и это приводит к искусственному усилению сигнала. Поэтому люцигенин подходит для качественной, но не для количественной регистрации супероксида [27]. Существуют и такие красители, за окислением которых под действием супероксида можно следить по флуоресценции. Среди них есть как цитоплазматически-направленные, так и митохондриально-направленные вещества. Совмещение хемилюминисцентных и флуоресцентных методов с конфокальной микроскопией и/или проточной цитометрией позволяет следить за образованием супероксида в клетках in situ.
За образованием супероксида можно следить спектрофотометрически по стехиометрическому восстановлению цитохрома с. Этот количественный метод успешно применяется для регистрации образования супероксида изолированными ферментами. Для регистрации супероксида внутри клеток и митохондрий этот метод неприменим, так как супероксид, образующийся внутри компартмента, отделенного от среды измерения мембраной, недоступен для добавленного снаружи цитохрома. Еще одно ограничение при использовании цитохрома с связано с его способностью акцептировать электроны не только от супероксида, но и от некоторых ферментов, катализирующих его образование. Поэтому при работе с такой системой регистрации необходимо вычленять чувствительный к супероксиддисмутазе компонент (СОД разрушает супероксид в реакции 2, а значит супероксид-зависимое восстановление цитохрома должно ингибироваться в присутствии СОД). Для достоверности получаемых результатов желательно, чтобы фоновая, СОД-нечувствительная активность составляла не более 15% от общей регистрируемой активности. Можно поступать и другим способом: проводить измерения в присутствии избытка СОД и регистрировать не супероксид, а стехиометрический продукт его дисмутации - перекись водорода. Такой приём особенно удобен в случаях, когда в качестве продуктов образуются одновременно перекись водорода и супероксид-радикал.
Способы изучения генерации АФК митохондриями
Влияние редокс-состояния и олигомерной формы ДЛДГ. В отличие от липоамидредуктазной, для диафоразной реакции не требуется активный дисульфид (ср. рис. 6Б и В) [112]. Искусственные акцепторы, в зависимости от их природы, принимают электроны непосредственно от полностью восстановленного флавина (ЕН2а и ЕН4 формы фермента) и/или от его семихинона (ЕН2б) (рис. 6В). Диафоразной активностью обладают и мономерная, и димерная формы ДЛДГ, а липоамидредуктазной - только димерная [137-139]. Перенос восстановительных эквивалентов с FADH2 на дисульфид фермента в свободном мономере невозможен, так как отсутствует гистидин (акцептор протона, обозначенный на рис. 6 как «В:»), необходимый для стабилизации тиолат-аниона, а значит, невозможно и восстановление липоамида.
рН-зависимости. Липоамидредуктазная активность имеет максимум при рН 5,6 [113, 140], добавление NAD+ приводит к сдвигу максимума липоамидредуктазной активности до 6,3 [140]. Диафоразная активность с феррицианидом в качестве акцептора электронов имеет максимум при рН 4,9, с пара-бензохиноном - при рН 6,0, а активность с DCPIP уменьшается при увеличении рН от 4,0 до 9,0 без выраженного максимума [141]. В 2005 году была предложена широкоцитируемая схема, согласно которой увеличение диафоразной активности ДЛДГ при закислении среды связано с диссоциацией димера ДЛДГ [138]. Однако это было опровергнуто: гель-фильтрационный анализ показал, что при изменении рН от 5,8 до 7,8 олигомерное состояние ДЛДГ остаётся неизменным [142]. Влияние SH-реагентов. Преинкубация фермента с арсенитом в присутствии NADH приводит к падению липоамидредуктазной активности на 80-90%, а DCPIP-редуктазная активность напротив, стимулируется в 10-20 раз [95, 109, 112, 129, 141]. Это связано с тем, что арсенит связывается с SH-группами в активном центре, и в ферменте, подверженном такой модификации, при добавлении NADH восстанавливается флавин, то есть образуется ЕН4-форма [115, 116, 130]. Моноалкилированние цистеина в активном центре ДЛДГ в результате обработки йодацетамидом в восстанавливающих условиях приводит к полному исчезновению активности фермента с липоамидом (как окисленным, так и восстановленным) [97, 143]. Хинонредуктазная активность (с менадионом) в результате моноалкилирования не увеличивается, что свидетельствует о том, что менадион (и, вероятно, другие хиноны) восстанавливается семихиноном флавина [143].
В составе ДЛДГ присутствует всего 8 остатков цистеина. Обработка ДЛДГ фенилмеркурийацетатом в присутствии NADH приводит к образованию производного, в котором алкилированы два цистеина активного центра фермента. Такая модификация приводит к исчезновению липоамидредуктазной активности и увеличению DCPIP-редуктазной активности, по той же причине, что и модификация арсенитом. Обработка ДЛДГ фенилмеркурийацетатом в отсутствие NADH выявляет 6 титруемых SH-групп, 2 из них алкилируются быстро, ещё 2 – медленно, и 2 – только в денатурирующих условиях. Цистеины активного центра в отсутствие NADH не модифицируются фенилмеркурийацетатом, тем не менее такая обработка также приводит к увеличению диафоразной активности – по всей видимости, при добавлении NADH к ферменту, алкилированному по двум легко-титруемым цистеинам, модификаторы переносятся с них на SH-группы активного центра. Это согласуется с наличием лаг-фазы в диафоразной активности такого фермента [144].
Влияние ионов металлов. Ионы кобальта Со2+ при щелочных рН образуют стехиометрический (1 моль Co2+ на моль FAD) комплекс с ДЛДГ, восстановленной с помощью NADH. Этот комплекс не обладает липоамидредуктазной активностью [145]. Ионы кадмия Cd2+ ингибируют липоамидредуктазную активность и стимулируют DCPIP-редуктазную активность [112]. Длительная инкубация ДЛДГ в присутствии ионов меди Cu2+ (в концентрациях, превышающих 0,5 моль Cu2+ на моль FAD фермента) приводит к исчезновению КАБНілипоамид-оксидоредуктазной и трансгидрогеназной активности (остаточная активность составляет 13, 6 и 13% в прямой, обратной и трансгидрогеназной реакциях, соответственно), существенному падению диафоразной активности с феррицианидом (при рН 4,8 остаточная активность составляет 30%). Диафоразная активность с DCPIP при нейтральных рН при этом увеличивается в 30 раз по сравнению с необработанным ферментом. Изменения активностей не обусловлены связыванием Си2+ с ферментом - в ДЛДГ, обработанной Си2+, а затем диализованной против буфера с ЭДТА, не обнаруживается следов меди, в то время как липоамидредуктазная и диафоразная активности после диализа остаются низкими [113]. Си2+ катализирует окисление двух -SH групп в ферменте с образованием дисульфида: количество -SH групп, определяемых в ДЛДГ после обработки ионами меди, уменьшается по сравнению с нативным ферментом, а диализ фермента, обработанного ионами меди, против буфера, содержащего цистеин, приводит к регенерации активностей нативного фермента [141, 146]. Модификация не затрагивает каталитически активный дисульфид [146]. Обработанный ионами меди фермент сохраняет способность восстанавливаться как до ЕН2, так и до ЕН4 формы, причем, четырехэлектронное восстановление становится предпочтительнее по сравнению с нативным ферментом: ЕН4 форма фермента образуется даже в присутствии NAD+ [147]. DCPIP, как двухэлектронный акцептор, лучше взаимодействует с ЕН4 формой фермента, и этим объясняется увеличение диафоразной активности с DCPIP после инкубации фермента с Си2+. Феррицианид, как одноэлектронный акцептор, лучше взаимодействует с семихинонной (ЕН2б) формой фермента, но может принимать электроны и от ЕН4, этим объясняется неполное исчезновение активности с феррицианидом после обработки ДЛДГ ионами меди [113]. Позднее было показано, что обработка ионами меди изменяет рН-зависимости реакций с разными акцепторами. В реакции с DCPIP при рН меньше 5,0 активности нативного и обработанного фермента совпадают, а при увеличении рН активность нативного фермента падает более резко, чем активность обработанного. В реакции с феррицианидом обработка медью приводит к смещению оптимума рН от 4,9 до 6,2.
Получение аммоний-чувствительной КАБНЮг-оксидоредуктазы из фракции митохондриального матрикса
Мы оценили вклад ДЛДГ в суммарную генерацию перекиси водорода митохондриями. Для этого использовали сопряженные препараты митохондрий сердца крысы (дыхательный контроль при окислении сукцината - 3,2 ± 0,4, при окислении малата в присутствии глутамата - 6,7 ± 0,1, табл. 9). Ионы аммония не влияли на скорость дыхания ни в состоянии 3, ни в состоянии 4.
Сукцинат-зависимая генерация перекиси водорода подавлялась ADP (табл. 10). Это подтверждает, что при окислении сукцината перекись водорода образуется преимущественно за счет обратного переноса электронов, катализируемого комплексом I. В присутствии ADP происходит синтез АТР и снижается цН+ на мембране митохондрий, необходимый для обратного переноса электронов. Ротенон, который блокирует перенос электронов с убихинола на комплекс I, также ингибировал сукцинат-зависимую генерацию. Остаточная активность была обусловлена комплексом III и сукцинатдегидрогеназой. ДЛДГ так же вносит вклад в генерацию - если цикл трикарбоновых кислот совершает обороты, то образуется NADH, который не окисляется под действием комплекса I, заблокированного ротеноном, и может служить донором электронов для ДЛДГ. О вкладе
Генерация перекиси водорода в присутствии NAD-зависимых субстратов (малат + глутамат) была ниже, чем в присутствии сукцината (табл. 10). Добавление ADP приводило к небольшому уменьшению скорости генерации. Решающим фактором, влияющим на скорость продукции АФК, в данном случае являлась не энергизация мембраны, а степень восстановленности редокс-компонентов ферментов. Об этом свидетельствует влияние ротенона на скорость генерации. При сопряженном окислении малата в присутствии глутамата добавление ротенона приводило к уменьшению степени энергизации мембраны (как и добавление ADP), однако скорость генерации не уменьшалась, а возрастала. Это обусловлено тем, что ротенон блокирует перенос электронов комплексом I от NADH на мембранный убихинон, что приводит к увеличению степени восстановленности флавина в ферменте и таким образом к увеличению скорости образования перекиси водорода. Ионы аммония стимулировали генерацию перекиси водорода в присутствии глутамата и малата, что свидетельствует о вкладе ДЛДГ в генерацию перекиси водорода интактными митохондриями.
В оптимальных для генерации условиях только 1,6% от общего потребления кислорода расходовалось на образование перекиси (сукцинат-зависимая генерация в состоянии 4), в присутствии глутамата и малата как субстратов дыхания эта цифра составляла только 0,68%, а при разобщенном дыхании, они падали до 0,06 и 0,07%, соответственно. В присутствии ионов аммония при сопряженном окислении сукцината и NAD-зависимых субстратов, доля кислорода, расходуемого на двухэлектронное восстановление, составила 4% и 2%, соответственно.
Надо заметить, что регистрируемая скорость генерации перекиси водорода интактными митохондриями зависит не только от активности самих «генераторов», но и от скорости транспорта субстратов дыхания и перекиси водорода через мембрану, а также от активности матриксных ферментов, отвечающих за утилизацию перекиси и супероксида. Кроме того, из данных, представленных в таблице 10, видно, что наибольшие скорости генерации наблюдались в условиях, когда внутримитохондриальные нуклеотиды были максимально восстановлены. Поэтому, чтобы зарегистрировать максимальные скорости генерации, которые способны обеспечивать комплекс I и другие ферменты в составе митохондрий, мы решили использовать экзогенный NADH. Для этого нам потребовалась пермеабилизация митохондрий (см. стр. 17).
Генерация перекиси водорода пермеабилизованными митохондриями Скорость окисления NADH интактными митохондриями составляла 0,06 мкмоль/мин на мг. После преинкубации митохондрий с аламетицином их NADH-оксидазная активность возрастала более чем в 20 раз (1,4 мкмоль/мин на мг). Высокая степень стимуляции свидетельствовала о целостности внутренней мембраны интактных митохондрий. Добавление к пермеабилизованными митохондриям NADH-OH (специфического ингибитора нуклеотидсвязывающего центра комплекса I) приводило к резкому падению NADH-оксидазной активности до 0,06 мкмоль/мин на мг.
В дальнейшем мы использовали NADH-OH для оценки вклада комплекса I в суммарное образование перекиси водорода пермеабилизоваными митохондриями6. В таблице 11 видно, что при окислении 50 мкМ NADH в отсутствие ионов аммония 50% генерации было обусловлено активностью комплекса I, а 50% – ДЛДГ (и, возможно, другими NADH-зависимыми ферментами). В присутствии ионов аммония скорость образования перекиси водорода увеличивалась в 4 раза и становилась гораздо менее чувствительной к NADH-OH, вклад комплекса I в генерацию уменьшался до 20%, а вклад ДЛДГ – возрастал.
Увеличение концентрации NADH до 2 мМ приводило к увеличению скорости генерации и к уменьшению вклада комплекса I в суммарную генерацию до 26% и 1% в отсутствие и в присутствии NH4Cl, соответственно. Это согласуется с данными о том, что генерация перекиси водорода комплексом I имеет оптимум при 50 мкМ NADH и падает при дальнейшем увеличении его концентрации [33], в то время как ДЛДГ-зависимая генерация перекиси в меньшей степени чувствительна к высоким концентрациям NADH.
Дыхание и продукция АФК митохондриями - сравнение потоков электронов
Увеличение концентрации аммония приводило к увеличению одновременно максимальной скорости генерации перекиси водорода и кажущейся константы Михаэлиса для NADH (рис. 14А). Одно из возможных объяснений этому факту состоит в том, что аммоний связывается в непосредственной близости к изоаллоксазиновому ядру FAD и уменьшает среднеточечный потенциал флавина. Если это так, то разность потенциалов между парами NAD+/NADH и Flокисл/Flвосст в присутствии аммония уменьшится, и внутримолекулярное равновесие в реакциях переноса электронов между NADH и флавином фермента (реакции 2 и 9 на рис. 27) сместится в сторону Е-NADH в реакции 2 и ЕН2-NADH в реакции 9. Это, в свою очередь, приведет к ухудшению сродства фермента к NADH и, следовательно, к повышению КМ. Следует отметить, что при насыщающих концентрациях NADH снижение потенциала флавина делает его лучшим донором электронов из-за увеличения разности потенциалов между парами Flокисл /Flвосст и/или пар CV О , 02/ Н202. К сожалению, титрование активности парой NAD+/NADH в присутствии и в отсутствие аммония (рис. 22Б, табл. 14) не дало нам подтверждения тому, что аммоний влияет на потенциал флавина, так как связывание фермента с субстратом/продуктом определённо вносило вклад в регистрируемые зависимости, и этот эксперимент нельзя считать потенциометрическим титрованием (см. стр 87 и 102). Другим возможным объяснением активирующего действия аммония может быть предположение о структурных изменениях в окружении флавина, происходящих после связывания положительно заряженного иона аммония. Такие изменения могут повышать доступность флавина для кислорода. В этом случае влияние аммония должно быть направлено на увеличение скорости окисления восстановленного флавина кислородом, при этом увеличится «каталитическая составляющая» константы Михаэлиса. Результатом будет повышение и максимальной скорости реакции, и величины КМ.
Если аммоний связывается рядом с FAD, это может объяснять, почему проверенные нами «аналоги» аммония не обладали похожим эффектом: все остальные соединения обладают большими размерами и их связывание может быть стерически невозможно. В то же время, это не объясняет, почему, например, только аммоний, но не K+, обладающий близким радиусом гидратации, оказывает влияние на активность ДЛДГ. О возможной роли ДЛДГ в продукции АФК в физиологических и патологических условиях Один из наиболее интересных вопросов, возникающих в связи с наличием сильного активирующего эффекта аммония на генерацию АФК под действием ДЛДГ, – насколько этот феномен важен для физиологии митохондрий.
Давно известен токсический эффект аммиака. Высокие концентрации аммония приводят к конвульсиям и летальным исходам через 10–15 минут после введения. Согласно наиболее распространенной точке зрения, летальный эффект аммония обусловлен его нейротоксичностью, однако основной механизм этого действия до сих пор не известен. Одно из объяснений нейротоксичности аммония – ингибирование синтеза нейротрансмиттера глутамата. Другое объяснение – это способность высоких концентраций NH4+ приводить к деполяризации мотонейронов, за счёт сходства с ионами K+ [270]. Существует точка зрения, что токсический эффект высоких концентраций аммония связан с ингибированием -КГДК [271, 272], а также с избыточной продукцией глутамина под действием глутаминсинтазы, однако, механизм токсичности глутамина не предложен [273].
Токсический эффект аммония наблюдается не только при инъекциях или вдыхании паров аммиака. При различных нарушениях в работе печени и почек, концентрации аммония в крови и в мозге могут увеличиваться в 3–5 раз. Такое состояние называют гипераммониемией. Она связана с возникновением и развитием печеночной энцефалопатии [273], синдрома Рея; развитие болезни Альцгеймера коррелирует с увеличением концентрации аммония в мозге [274].
Стационарная концентрация аммония в митохондриях должна зависеть от скорости работы ферментов, продуцирующих аммоний, и ферментов, утилизирующих его (табл. 15). Активности этих ферментов регулируются различными факторами, в том числе степенью восстановленности пула нуклеотидов, соотношением ATP/ADP, поэтому стационарные концентрации аммония в митохондриях должны зависеть от их физиологического состояния. Таким образом, Н2О2-генерирующая активность ДЛДГ находится в тесной связи с азотистым обменом. Отдельного интереса в этом контексте заслуживает система расщепления глицина. В состав этого мультиферментного комплекса входит ДЛДГ, а одним из продуктов реакции, которую катализирует этот комплекс, является аммоний (табл. 15). Система расщепления глицина играет важную роль в перерождении клеток и онкогенезе, однако это явление в клетках млекопитающих изучено плохо, и точный механизм остаётся неизвестным [275].
Другой фактор, который должен оказывать влияние на концентрацию аммония в митохондриях, – его способность проникать через внутреннюю мембрану. Данные, полученные по изучению набухания митохондрий, показывают, что аммоний диффундирует через внутреннюю мембрану [276]. Однако это не противоречит возможности наличия специфических переносчиков для аммония. В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что аквапорин-8, локализованный во внутренней мембране митохондрий, способен обеспечивать неэлектрогенный транспорт депротонированной формы аммония, увеличивая проницаемость мембраны в 3–5 раз [277, 278]. В силу того, что механизм транспорта аммония не является полностью изученным, нельзя отрицать возможности существования градиента концентрации аммония на мембране митохондрий. Более того, показано, что инъекции высоких доз аммония in vivo оказывают ингибирующее влияние на дыхание митохондрий в присутствии сукцината и пары глутамат-малат, измеренное ex vivo [279], в то время как in vitro аммоний не оказывает существенного влияния на дыхание митохондрий (что подтверждено в нашей работе). Одно из возможных объяснений этого явления – способность аммония аккумулироваться в митохондриях и достигать, таким образом, более высоких концентраций, чем при добавлении аммония к митохондриям in vitro. Интересно было бы сравнить скорости генерации перекиси водорода интактными митохондриями, окисляющими «классические» интермедиаты цикла Кребса (сукцинат, малат + пируват), и митохондриями, окисляющими аммоний-продуцирующие субстраты (например, глутамин).
Концентрация аммония в плазме крови человека в среднем составляет 14–80 мкМ7 [280]. Максимальная концентрация аммония в крови наблюдается в портальной вене и составляет 0,2–0,4 мМ. Средние концентрации аммония составляют 0,24 мМ в эритроцитах человека [281], 0,16–0,33 мМ в мозге [282], 0,23–0,65 мМ в покоящихся мышцах [283, 284] и 0,7 мМ в печени [285] крысы. В активных мышцах концентрация аммония может возрастать до 1,2–2,4 мМ [284]. В перфузируемом сердце концентрация аммония составляет 1,5–1,9 мкмоль аммония на грамм сырого веса ткани [286]. Если считать, что плотность ткани равна единице, то это соответствует концентрации 1,5–1,9 мМ.
Сведения о содержании аммония в митохондриях различных тканей немногочисленны. В митохондриях печени крысы общая концентрация аммония, определяемая после осаждения белков хлорной кислотой, и рассчитанная с учетом содержания воды в матриксе, составляет 5,2 мМ. При этом около 80% аммония высвобождается в процессе удаления белков из экстрактов, и в интактных митохондриях находится в метаболически-неактивном состоянии [287, 288]. В митохондриях сердца определённая таким же способом концентрация аммония составляет 4,2 мМ. [288]. В митохондриях из мозга крысы концентрация аммония, составляет 12 мМ у контрольных животных и 60 мМ у животных через 15 минут после внутрибрюшинного введения ацетата аммония (7 ммоль/кг) [279]. Нужно заметить, что после введения хлорида аммония (17 ммоль/кг) концентрация аммония в мозге составляет 5,5 мМ (у контрольных животных – 0,3 мМ) [282]. Это служит еще одним аргументом в пользу того, что аммоний аккумулируется в митохондриях. Если считать, что концентрация аммония в митохондриях в нормальных условиях составляет 5–10 мМ, то скорость продукции перекиси водорода ДЛДГ будет изменяться линейно при незначительных колебаниях концентрации аммония. Таким образом, высокая константа активации позволяет обеспечивать тонкую регуляцию скорости генерации перекиси водорода на фоне высоких фоновых концентраций аммония. При гипераммониемии Н2О2-генерирующая активность ДЛДГ может быть определяющей в продукции АФК в митохондриях. Таким образом, токсический эффект аммония может быть обусловлен избыточной продукцией перекиси водорода.
Показано, что гипераммониемия развивается также при ишемии и аноксии [282, 289]. Одновременно с этим при ишемии происходит увеличение восстановительного потенциала митохондриального матрикса, так как в отсутствие кислорода NADH не реокисляется дыхательной цепью. Таким образом, следующая за ишемией реперфузия может сопровождаться очень активным производством перекиси водорода ДЛДГ, потому что в этих условиях присутствуют все три фактора, обеспечивающие её активность: наличие кислорода при низком соотношении NAD+/NADH и повышенная концентрация аммония.
Наблюдаемое увеличение продукции АФК в мозге у пациентов с болезнью Альцгеймера также может быть обусловлено активностью ДЛДГ, так как концентрация аммония в мозге при этом заболевании увеличивается [181].
Стоит признать, что большая часть приведенных в этом подразделе рассуждений носит гипотетический характер, и мы не располагаем данными, позволяющими уверенно судить о физиологической значимости сильной активации митохондриальной продукции АФК ионами аммония. Тем не менее, мы предполагаем, что физиологическая роль ДЛДГ как генератора перекиси водорода, может быть особенно выражена в патологических состояниях: при гипераммониемии, вызванной отравлением аммиаком или нарушениями в работе печени и почек, при ишемии и реперфузии.