Введение к работе
Актуальность проблемы. Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет прямого действия - возбуждения и ионизации макромолекул, так и путем косвенного действия - образующихся в результате радиолиза воды высокореакционных свободных радикалов [Кудряшов, 2004]. Преобладающая часть повреждений биополимеров в клетке, индуцированных ионизирующей радиацией, образуется в результате окислительного стресса. Окислительный стресс - это нарушение в биологической системе баланса между прооксидантами и возможностью их нейтрализации в системе антиоксидантной защиты [Halliwell, Gutteridge, 1982]. При воздействии ионизирующего излучения окислительный стресс обусловлен образованием активных форм кислорода (АФК) в результате радиолиза воды [Ward, 1988]. Поскольку АФК, за исключением перекиси водорода, являются короткоживущими продуктами, то этот процесс происходит непосредственно во время облучения.
Для нейтрализации избыточного количества АФК в клетках имеется многофункциональная система антиоксидантной защиты в виде разнообразных перехватчиков радикальных продуктов радиолиза воды, а также ферментных систем нейтрализации радикалов. Увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше возможности их нейтрализации системой антиоксидантной защиты клетки вызывает окислительный стресс, приводящий к повреждениям биологических молекул и необходимости их элиминации или репарации. Возникает необходимость активизации различных защитных и адаптационных клеточных механизмов для преодоления повреждающих последствий окислительного стресса. Определенное количество АФК постоянно образуется в клетке в результате нормальных аэробных биохимических реакций и необходимо для осуществления редокс-регуляции различных клеточных функций. Существенная роль в сигнально-регуляторных клеточных процессах принадлежит перекиси водорода - долгоживущей формы АФК [Stone, Yang, 2006; Forman, Maiorino, Ursini, 2010].
В настоящее время установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации на биологические объекты мишенями являются вода и белки. Белки являются более чувствительной мишенью, чем ДНК и липиды для реакции с гидроксильным радикалом (ОН^) - наиболее реакционноспособной АФК [Du, Gebicki, 2004]. Это обусловлено тем, что среди биополимеров содержание белкового компонента в клетке является наибольшим и составляет около 15% ее общей массы и 70% сухой массы [Gracanin et al., 2011] и они содержат ряд высокореакционных групп [shtarkman et al., 2008] .
При повреждении белков ионизирующей радиацией в присутствии кислорода возникает ряд окисленных продуктов, время полужизни которых может составлять несколько часов и более [Stadtman, 1993]. Среди них важную роль занимают гидропероксиды белков и аминокислот [Rahmanto et al., 2010]. Первичное окисление белков и свободных аминокислот с образованием их пероксидов может вызывать ряд цепных реакций, что в конечном итоге приводит к повреждению других биомолекул, включая ДНК и белки [Rahmanto et al., 2010]. Предполагается, что окисление белков свободными радикалами участвует в процессе клеточного старения и инициирует ряд болезней человека [Hawkins, Davies, 2001].
Под влиянием ионизирующей радиации, наряду с короткоживущими продуктами радиолиза воды, в клетках млекопитающих образуются долгоживущие радикалы, преимущественно локализованные на белках [Kumagai et al., 2002]. С помощью метода ЭПР установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации (кГр) в клетках и в растворах различных белков образуются долгоживущие радикалы белков (ДЖРБ) [Koyama et al., 1998, Kumagai et al., 2002], время полужизни которых достигает 20 ч [Miyazaki et al., 2002]. В настоящее время возникновение ДЖРБ показано для многих белков под влиянием ионизирующего излучения и ряда других воздействий. ДЖРБ образуются под воздействием гамма, рентгеновского, ультрафиолетового излучений, пероксинитрита и продуктов разложения перекиси водорода иммобилизованной пероксидазой [Гудков и др., 2007]. Под влиянием ДЖРБ в ДНК in vitro происходит образование 8- оксогуанина (8-оксо-7,8-дигидро-8-оксогуанина) - биомаркера повреждений ДНК, вызываемых АФК [Luxford et al., 1999, 2000; Furukawa et al., 2005; Midorikawa, 2005; Гудков и др., 2007]. Установлено, что ДЖРБ in vivo вызывают мутации и приводят к трансформации клеток [Koyama et al., 1998]. В небольших количествах ДЖРБ образуются в клетках животных и растений при их нормальной жизнедеятельности [Miyazaki et al., 2002]. Было показано, что аминокислоты, так же, как и белки, способны к образованию долгоживущих радикалов в результате воздействия ионизирующего излучения [Блюменфельд, Калмансон, 1958; Гудков и др., 2010]. В связи с этим актуальным является исследование возможности индукции пролонгированного окислительного стресса долгоживущими радикалами белка (ДЖРБ) после облучения, их роли в окислительном повреждении ДНК и генотоксического действия в клетках млекопитающих.
Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании генотоксического потенциала ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением.. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
-
Выявить образование ДЖРБ in vitro при воздействии ионизирующего излучения в дозе 10 Гр и определить время их полужизни.
-
Исследовать генерацию активных форм кислорода под влиянием ДЖРБ как механизм индукции пролонгированного окислительного стресса после воздействия ионизирующего излучения.
-
Определить способность ДЖРБ вызывать окислительные повреждения ДНК in vitro и in vivo.
4. Установить возможность нейтрализации окислительного стресса, обусловленного ДЖРБ, некоторыми природными антиоксидантами после облучения.
Научная новизна. Впервые установлено образование АФК ^О2, НО2\ Н2О2 и ОН^) в водных растворах под действием ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, а также исследован физико-химический механизм этого процесса. Образование АФК под влиянием ДЖРБ является причиной повреждений ДНК в модельных системах in vitro и длительного протекания окислительного стресса после воздействия ионизирующей радиации в организме млекопитающих, приводящего к повреждениям ДНК в клетках их красного костного мозга.
Впервые показана способность ДЖРБ, индуцированных рентгеновским излучением, вызывать окислительные повреждения в ДНК in vivo при их внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном введении. Установлено, что потребление грызунами некоторых природных антиоксидантов после облучения позволяет значительно снизить окислительные повреждения ДНК, обусловленные ДЖРБ, в клетках их красного костного мозга.
Научно-практическая ценность. Разработана методика регистрации ДЖРБ с применением хемилюминесценции белковых растворов, индуцированной рентгеновским излучением. Показан распад ДЖРБ, индуцированных ионизирующим излучением, и потеря их генотоксических свойств через сутки после облучения. Установлена возможность эффективной нейтрализации окислительного стресса и генотоксического действия, обусловленного ДЖРБ природными антиоксидантами - инозином (рибоксином), метионином и триптофаном.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 11-12, 14-15-й конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007-2008, 2010-2011), на конференции «Биомедицинская инженерия» (Пущино, 2007), на VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008), на Конгрессе «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт- Петербург, 2008, 2011), на конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Белоруссия, Минск, 2008), на VIII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва, 2009), на IX Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2010), на III Всероссийском конгрессе «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), на VI Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010), на VII Международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2011), на конференции «Радиация и Чернобыль: Наука и практика». (Белоруссия, Гомель, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах, 4 - из списка ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), методической части, полученных результатов и их обсуждения (2 главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (204 источника). Работа иллюстрирована 13 рисунками и содержит 8 таблиц.
Похожие диссертации на Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением
