Введение к работе
з
Актуальность работы. Полярные жгутики ассоциативных микроорганизмов рода Azospirillum являются одними из главных клеточных структур, определяющих успешность взаимодействия азоспирилл с растениями. Они отвечают за направленное перемещение бактерий (Zhulin and Armitage, 1993), выполняют функцию адгезинов (Michiels et al., 1991), участвуют в реализации социальной подвижности (Кацы, 2007) и представляют собой один из важнейших поверхностных антигенов азоспирилл (Бурыгин, 2003).
Гликозилирование белка в прокариотических организмах - относительно редкий процесс посттрансляционной модификации. Более десяти лет назад был установлен факт гликозилирования главного структурного белка азоспирилл -флагеллина (Moens et al., 1995а), что ставит эти бактерии в один ряд с такими представителями прокариот как Campylobacter (Logan et al., 1989), Helicobacter (Josenhans et al., 1999), Aeromonas (Rabaan et al., 2001), Caulobacter (Johnson et al., 1983), Pseudomonas (Takeuchi et al., 2003), Agrobacterium (Deakin et al., 1999), Listeria (Schirm et al., 2004), Clostridium (Arnold et al., 1998). Однако до сих пор в известной нам литературе отсутствуют сведения о размерах, структуре и функциях (9-связанного углевода гликозилированного флагеллина полярного жгутика А. brasilense Sp7, а также о наличии углеводных фрагментов в составе флагеллинов других штаммов азоспирилл. Отчасти это объясняется сложностью получения достаточных для анализа объемов химически чистого гликозилированного флагеллина, освобожденного от весьма прочно ассоциированного с ним чехла полисаха-ридной природы, который изолирует от окружающей среды филамент полярного жгутика азоспирилл (Бурыгин с соавт., 2007). Это обстоятельство делает актуальными усилия, направленные на разработку приемов выделения и очистки гликозилированного флагеллина данных почвенных бактерий.
Изучение структуры и свойств полярных жгутиков ассоциативных азоспирилл является весьма перспективной фундаментальной задачей, имеющей большое значение для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями. При этом следует отметить, что изучение гликозилированных бактериальных флагеллинов представляет несомненный практический интерес, поскольку основанная на полученных знаниях углеводная инженерия может способствовать решению проблемы микробного производства гликопротеинов с заданными свойствами.
Целью настоящей работы было получение новых сведений о строении и свойствах гликозилированного флагеллина полярного жгутика ассоциативных бактерий рода Azospirillum.
Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:
Оптимизировать способ препаративного получения химически чистого гликозилированного флагеллина полярного жгутика бактерий рода Azospirillum.
Изучить структуру углеводных фрагментов флагеллина типового штамма A. brasilense.
Провести сравнительный анализ антигенных свойств белковых и углеводных доменов флагеллинов различных штаммов азоспирилл.
Оценить вариабельность углеводных фрагментов в составе флагеллина у штаммов азоспирилл, относящихся к различным О-серотипам.
Научная новизна работы.
Проведена оптимизация метода выделения и очистки гликозилированного флагеллина полярного жгутика азоспирилл, позволившая впервые получить данный белок в препаративном количестве. В работе впервые показано наличие нетипичной для бактериальных гликозилированных флагеллинов доли углеводных фрагментов у типового штамма A brasilense Sp7. Впервые установлено строение повторяющегося звена (9-связанного полисахарида, входящего в состав молекулы гликозилированного флагеллина полярного жгутика A brasilense Sp7, состоящего из остатков рамнозы, глюкозамина, фукозы и галактозы. Впервые показана серологическая вариабельность углеводных фрагментов флагеллинов азоспирилл.
Практическая значимость работы.
Выделены и иммунохимически охарактеризованы флагеллины 22 штаммов бактерий рода Azospirillum, которые могут быть рекомендованы к использованию в in vitro экспериментах по исследованию роли этих структур в реализации различных типов межорганизменных взаимодействий. Полученные в работе препараты были использованы при выполнении плановых НИР ИБФРМ РАН. Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами химического факультета Саратовского госуниверситета.
Основные положения, выносимые на защиту:
Типовой штамм A. brasilense Sp7 обладает нетипичной для бактериальных гликозилированных флагеллинов долей углеводных фрагментов, представленных полисахаридом. Соотношение белковой и углеводной долей флагеллина составляет 3:1.
Углеводные фрагменты флагеллина полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7 состоят из остатков рамнозы, глюкозамина, фукозы и галактозы в равном соотношении.
Серологическая вариабельность углеводных фрагментов сочетается с родовой специфичностью белковых детерминант флагеллина азоспирилл.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 2-ой и 4-ой Региональных и 5-ой Всероссийской конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2004; 2008; 2010); Международной научной конференции молодых ученых «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); 12-й, 13-ой и 14-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008; 2009; 2010) и 5-й Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009).
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН 8 октября 2010 года.
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев СЮ.) и «Комплексный иммунохимический анализ эктосимбиотических растительно-микробных систем» (№ гос. регистрации 01200904388, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для молодых российских ученых и ведущих научных школ Российской Федерации.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) сняты и расшифрованы совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных источников, содержащего 192 наименования. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 1 таблицу.
