Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
РЕГУЛЯЦИЯ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ АССИМИЛЯЦИИ АММОНИЯ У ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ГЛАВА I. Общая характеристика ферментов ассимиляции аммония
-
Пути ассимиляции аммония 13
-
Общая характеристика ГС, ГОГАТ и ГДГ 14
-
Глутаминсинтетаза 15
-
Глутаматсинтаза 24
-
Глутаматдегидрогеназа 26
ГЛАВА 2. Зависимость активности ГС, ГДГ и ГОГАТ хлореллы от условий азотного питания
-
Регуляция путей ассимиляции аммония у прокариотов 33
-
Зависимость активности ГС и ГОГАТ хлореллы от условий азотного питания 34
-
Индукция НАДФ-ГДТ у хлореллы при ассимиляции экзогенного аммония ..... 36
ГЛАВА 3. Свойства ГДГ одноклеточных зеленых водорослей
-
Физико-химические свойства ГДГ одноклеточных зеленых водорослей 40
-
Кинетические свойства ГДГ одноклеточных зеленых водорослей 46
ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ГЛАВА I. Объект исследования I.I Использованные виды и штаммы одноклеточных зеленых водорослей и условия их культивирования. . . 53
стр.
. 1.2 Получение бесклеточных экстрактов . 56
ГЛАВА 2. Методы определения активности ферментов асси
миляции аммония и определения концентрации
белка
2,1. Определение активности ГДТ 59
-
Определение активности ГС .... 60
-
Определение активности ГОГАТ 61
-
Определение концентрации белка ........ 63
ГЛАВА 3. Методы разделения, очистки и изучения физико-химических СВОЙСТВ ГДТ ИЗ A«braunii
-
Разделение двух ГДТ 65
-
Использованные приемы очистки ГДТ
-
Прогревание препаратов НАД(Ф)-ГДТ .... 65
-
Ультрафильтрация 66
-
Фракционирование сульфатом аммония .... 67
-
Сорбция на геле фосфата кальция 67
-
Хроматография на АН-сефарозе 4В 68
-
Ионообменная хроматография 68
-
Гель-фильтрация 69
-
Аффинная хроматография 70
-
Диск-электрофорез в полиакриламидном геле и проявление зимограмм тетразолиевым методом 70
-
Определение молекулярных масс ГДТ
3.4.1 Определение молекулярных масс нативных ГДТ
из A.braunii методом гель-фильтрации . . 72
3.4.2 Определение молекулярной массы субъединиц
НАД(Ф)-ГДТ 73
3.5 Определение содержания <*-спиральной структуры 74
стр. ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА I, Зависимость активности ферментов ассимиляции аммония одноклеточных зеленых водорослей от условий азотного питания
-
Зависимость активности ГДТ одноклеточных зеленых водорослей от условий азотного питания. Изо-ферментный состав ГДТ одноклеточных зеленых водорослей . 75
-
Зависимость активности ГС одноклеточных зеленых водорослеіот условий азотного питания 83
1,3. Локализация места синтеза индуцируемой аммонием
НАДФ-ГДТ хлореллы, конститутивной НАДФ-ГДТ и ГС
A.braunii ..... . . . . 85
1.4 Зависимость активности ГОГАТ одноклеточных зеленых водорослей от условий азотного питания ... 9G
Заключение 96
ГЛАВА 2. Свойства ГДТ из клеток A.braunii
2.1 Разделение и очистка ГДТ A.braunii
-
Разделение ГДТ 97
-
Очистка НАД(Ф)-ГДТ 97
-
Очистка НАДФ-ГДТ 99
2.2 Физико-химические свойства ГДТ A.braunii
-
Молекулярная масса 104
-
Тепловая инактивация 104
-
Влияние диссоциирующих агентов 108
-
Дейотвие пара-оксимеркурибензоата (пОМБ) . . ИЗ
2.3 Кинетическое поведение ГДТ A.braunii
2.3,1 Зависимость активности ГДТ от концентрации
восстановленных кофакторов . 120
стр.
-
Зависимость активности ГДГ от концентрации 2-оксоглутарата 125
-
Зависимость активности ГДГ от концентрации
ионов аммония 131
-
Кинетическое поведение ГДГ в реакции окислительного дезаминирования 137
-
Влияние продуктов реакции на активность ГДГ A.braunii . Физиологическая роль ГДГ . . . 137
Заключение 141
ВЫВОДЫ 143
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 145
ПРИЛОЖЕНИЕ - 166
Введение к работе
"Цель стремлений физиологии растений заключается в том, чтобы изучить и объяснить жизненные явления растительного организма и не только изучить и объяснить их, но путем этого изучения и объяснения вполне подчинить их разумной воле человека, так чтобы он мог по произволу видоизменять, прекращать или вызывать эти явления". (Тимирязев, 1957). Эти слова, сказанные К.А.Тимирязевым более ста лет назад, в 1878 году, на акте Петровской земледельческой и лесной академии, остаются в полной мере актуальными и по сей день, причем применительно не только к физиологии, но и к биохимии растений. Особенно это касается проблемы усвоения неорганических форм азота растениями, поскольку "одной из наиболее острых проблем, стоящих перед человечеством в настоящее время, является недостаток продовольствия и в первую очередь недостаток пищевого и кормового белка. Рассматривая эту проблему в самых разнообразных аспектах, мы должны всегда иметь в виду, что в конечном счете первичным источником белка на нашей планете являются растительные организмы с их замечательной способностью синтезировать белок из углекислоты, воды и неорганических источников азота... Поэтому понятно, какое большое теоретическое и практическое значение имеют исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе усвоения азота растениями и его превращения в аминокислоты и белки" (Кре-тович, 1980).
Известно (Кретович, 1972; Fowden , 1979; Молек.мех.усвоения азота растениями, 1983), что источниками автотрофного питания растений могут служить разнообразные азотсодержащие соединения (молекулярный азот атмосферы - n2 , нитрат - no~ , мочевина -Ш2-со-ш2 ) , однако из всех этих соединений образуется аммиак (шц ), который затем в форме иона аммония ( nhJ ) используется для биосинтеза аминокислот и амидов, являющихся строительным материалом для образования белков и различных азотсодержащих соединений растительной клетки. Аммоний, таким образом, занимает центральное место в метаболизме азота у растений. По образному выражению Д.Н.Прянишникова "Аммиак есть альфа и омега в обмене азотных веществ у растений..." (Прянишников, 1953). Поэтому выяснение механизмов его ассимиляции, свойств и регуляции ферментов, катализирующих эти процессы, является основополагающим при изучении азотного обмена растений. Результаты таких исследований, с одной стороны, вносят существенный вклад в биохимию и энзимо-логию растений, а, с другой стороны, имеют практическое значение, т.к. на их основе создается возможность целенаправленного повышения продуктивности растений.
Среди растительных организмов важное место занимают одноклеточные зеленые водоросли. Они очень широко распространены на земле и играют существенную роль в различных биоценозах (Шизнь растений, 1977). Ввиду простоты их культивирования и уникальной пластичности обмена веществ, одноклеточные зеленые водоросли уже в течение длительного времени привлекают к себе внимание исследователей как удобный с физиологической и биохимической точки зрения объект. Достаточно упомянуть, что восстановительный пен-тозофосфатный цикл (цикл Кальвина) открыт с использованием хлореллы (Bassham et al.t 1954).
В настоящее время ставится вопрос о широком практическом использовании одноклеточных зеленых водорослей в народном хозяйстве в качестве перспективного источника кормового белка и различных физиологически активных соединений, а также как средства регенерации воздуха и утилизации отходов жизнедеятельности в замкнутых экосистемах. Уже сейчас имеются отдельные примеры их эффективного использования (Музафаров, Таубаев, І974;І983), а в будущем можно ожидать, что биомасса или белковые и витаминные изоляты, полученные из одноклеточных зеленых водорослей, найдут широкое применение в животноводстве и птицеводстве.
Вот почему вполне ясен постоянный интерес исследователей к этим организмам, и, в частности, к изучению их азотного обмена (Syrett , I954;I962; Morris, 1974; Syrett,Leftiey , 1976). Перечисленные обзоры затрагивают общие вопросы азотного обмена: накопление аминокислот и амидов, белка, накопление азота в растворимой и нерастворимой фракциях клеток при различных условиях азотного питания. Вместе с тем, работ, посвященных изучению ферментов, катализирующих первичные реакции ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей, до недавнего времени было чрезвычайно мало ( Backer,Tompson , 1961; Morris,Syrett , 1965; Романов и др., 1965). Такими ферментами являются: глутаминсинтета-за (ГС, КФ 6.3.1.2) и глутаматдегидрогеназа (ГДТ, КФ I.4.I.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4). Сюда же в последнее время относят открытую в 1970 году ( Tempest et ai.,1970) глутаматсинтазу (ГОГАТ, КФ I.4.1.13 и 1.4.7.1), катализирующую восстановительный перенос амидной группы глутамина на 2-оксоглутарат с образованием двух молекул глутаминовой кислоты. Считают, что в ассимилирующих аммоний тканях растений ГС и ГОГАТ функционируют согласованно, обеспечивая тем самым непрерывность канала, по которому аммоний превращается в ^.-аминный азот, и образуют один путь ассимиляции, другой путь обеспечивает функционирование ГДТ ( Miflin, Lea , 1976).
Впервые систематическое и целенаправленное изучение энзимологии ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей было начато в конце 60-х годов в лаборатории энзимологии Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР. В ходе этих исследований у одного ИЗ ТерМОфИЛЬНЫХ ШТаММОВ ХЛОрелЛЫ Chlorella pyrenoidosa Pringeheim 82Т были обнаружены следующие ферменты ассимиляции аммония: а) ГС (Романов и др., 1965), для которой была изучена динамика изменения активности в синхронной культуре хлореллы (Селиванова и др., 1980), регуляция синтеза и активности различными источни ками азотного питания (Евстигнеева и др., 1971 а; Акимова и др., 1976 а,б;1977), кинетика ферментативного действия (Кретович и др., 1972; Громыко и др., 1973; Акимова и др., 1976 а,б; Расу- лов и др., 1978 а,б), а также некоторые физико-химические свой ства и четвертичная структура фермента (Расулов и др., 1977 а,б); б) неспецифичная к кофактору, конститутивная НАД(Ф)-ГДГ (Романов и др., 1965; Шатилов и др., 1969; Томова и др., 1969); в) НАДФ-специфичная ГДГ, причем впервые было показано, что эта ГДГ, отсутствующая в клетках при выращивании хлореллы на среде с нитратом, синтезируется de novo в присутствии экзогенного аммо ния (Шатилов и др., 1970; Томова и др., 1970), что позднее было подтверждено американскими исследователями с использованием дру гого термофильного штамма хлореллы (таїїеу et ai.,I972).
Конститутивная НАД(Ф)-ГДГ и индуцируемая ионами аммония НАДФ-ГДГ были выделены из клеток хлореллы и было проведено сравнительное изучение их физико-химических и кинетических свойств (Shatilov,Kretovich , 1977).
В клетках Ch.pyrenoidosa 82Т была также обнаружена аланин-дегидрогеназа (Шатилов и др., 1968; Томова и др., 1970). Кроме того, имелась единственная работа ( Lea,Mifiin , 1975), в которой было показано наличие в клетках Ch.fusca ферредоксин (Fd )-зависимой ШТАТ.
Таким образом, к началу выполнения данного исследования в клетках хлореллы были обнаружены практически все ферменты первичной ассимиляции аммония. Однако большинство из вышеупомянутых работ было выполнено лишь на одном штамме хлореллы, а, как известно (Рудова, 1981), даже у представителей одного рода Chioreiia наблюдаются существенные различия в биохимических признаках. Поэтому имевшихся данных было совершенно недостаточно для того, чтобы сделать определенные выводы относительно существования каких-либо общих механизмов регуляции синтеза и активности ферментов ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: установить, какие молекулярные формы ГДТ характерны для различных одноклеточных зеленых водорослей и насколько широко распространено явление индукции НАДР-ГДТ под влиянием высоких концентраций аммония; исследовать механизмы регуляции синтеза и активности ГДТ, ГС и ГОГАТ источником азотного питания у одноклеточных зеленых водорослей; разработать схему выделения и очистки ГДТ из одного из видов одноклеточных зеленых водорослей и провести сравнительное изучение их физико-химических и каталитических свойств; выяснить направленность функционирования различных ГДТ и, таким образом, установить, каковы пути ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей.
В результате проведенных исследований на примере 8 различных представителей одноклеточных зеленых водорослей, шесть из которых относятся к роду Chioreiia и еще по одному к родам Anki-strodesmus и Scenedesraua , впервые установлено, что для всех - II - одноклеточных зеленых водорослей характерно наличие конститутивной неспецифичной к кофактору НАД(Ф)-ГДТ. Явление индукции синтеза de novo НАДФ-специфичной ГДТ под влиянием ионов аммония обнаружено у еще одного представителя рода Chioreiia -термофильного штамма chioreiia вр.к* Установлено, что у представителей родов Ankistrodesmus и Scenedesmus НАД(Ф)-ГДТ и НАДФ-ГДТ являются конститутивными ферментами, причем синтез последней резко усиливается при голодании клеток по азоту. У всех изученных одноклеточных зеленых водорослей найдена ГС и Fd -зависимая ГОГАТ. Впервые показан однотипный характер регуляции синтеза ГС у всех одноклеточных зеленых водорослей, который осуществляется по принципу репрессия-дерепрессия. Зависимости активности ГОГАТ от условий азотного питания для большинства водорослей не обнаруЕено, за исключением двух штаммов хлореллы Сп. pyrenoidosa82Tn Ch. sp.K, для которых показано некоторое увеличение активности при голодании клеток по азоту. Установлено также, что индуцируемая ионами аммония НАДФ-ГДТ из cn.pyreno- idosa 82Т И Gh,sp.K КОДИруеТСЯ ЯДврНЫМ ГЄНОМОМ И СИНТЄЗ ЄЄ осуществляется в цитоплазме на 80S рибосомах. Напротив, конститутивная НАДФ-ГДТ И ГС в клетках Ankistrodesmus braunii кодируются, видимо, геномом хлоропластов, а синтез их осуществляется при участии как органельных 70 s, так и цитоплазматичес-ких 80S рибосом.
Разработана схема выделения, разделения и очистки двух конститутивных ГДГ-З ИЗ КЛетОК A.braunii , при ЭТОМ Предложен НОВЫЙ оригинальный способ разделения этих ферментов, который защищен авторским свидетельством (см. приложение). В результате применения разработанной схемы очистки НАД(Ф)-ТДГ получена в гомогенном состоянии, а НАДФ-ГДТ - в высокоочищенном состоянии; проведено сравнительное изучение их физико-химических и каталитических свойств, которые оказались близкими к свойствам соответствующих глутаматдегидрогеназ, полученных ранее из Ch.pyrenoidosa 82Т. На основании результатов изучения динамики изменения активности НАДФ-зависимой и неспецифичной к кофактору ГДТз в процессе роста культуры A.braunii , а также на основании данных по изучению свойств этих ферментов сделан вывод об анаболической функции НАДФ-ГДГ и катабожческой роли НАД(Ф)-ГДГ. Совокупность полученных данных указывает на существование двух путей ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей, функционирование которых регулируется концентрацией ионов аммония в клетке.
Таким образом, полученные в настоящей работе данные, вносят существенный вклад в развитие фундаментальных представлений о путях ассимиляции аммония и их регуляции у растительных организмов, а также в характеристику отдельных ферментов ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей. Кроме того, практическое значение имеет предложенный способ разделения ГДТ, который уже используется для разделения ГДТ других одноклеточных зеленых водорослей, а также может использоваться в лабораторной практике и, возможно, в промышленных условиях для разделения и очистки различных ферментов. - ІЗ -
ЧАСТЬ І
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
РЕГУЛЯЦИЯ И СВОЙСТВА ФЕРМШТОВ АССИМИЛЯЦИИ АММОНИЯ У ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
