Введение к работе
Актуальность проблемы. Зерновые культуры обеспечивают почти половину всех запасов белка для человечества. Ваззигл направлением в решении задачи повышения продуктивности зерновых культур и увеличения их белковости является изучение ЭНЗПМ0Л0-гии биохимических процессов, леяащих в основе усвоения растениями неорганического азота (Прянишников,1945; Кретовяч,1954).
Изучение уровня активности ферментов и органной топография процессов, определяющих усвоение неорганического азота (Измайлов, I98S), актуально как о теоретической, так и с практической точки зрения. На этой основе могут о успехом решаться не только вопросы диагностики обеспеченности растений азотом, необходимости и сроков внесения азотних удобрені!,", но и вопросы способа внесения этих удобрений в целях получения максимальной продуктивности сельскохозяйственных растений.
Знание особенностей распределения активности ферментов, катализирующих реакции ассимиляции минерального азота мояду различными органами, представляет значительный интерес в создании теоретических основ для целенаправленных селекционных работ по получению оортов о высокой ассимилирующей способностью и, соответственно, с повышенным содержанием белка в зерне. Усвоение аммиака растениями может происходить, в первую очередь, .с помощью фермента глутаминсинтетазы (ГС, КЭ 6.3.1.2.), а такзее глутачатдегядрогеназы (ГДГ, KS 1,4.1.2; І.4.І.З; 1.4.1.4).* Образующийся глутамин используется на синтез ряда ваннейших азотсодержащих соединений клетки, в том числе на синтез глутаминовой киолоты в реакции, катализируемой глута-матсинтазой (ГОГАТ, Г2> 1.4.1.13; 1.4.1.14; 1.4.7.1).
В настоящее время сложилось представление, что главный путь ассимиляции аммвака у растений проходит через реакции, катализируемые ГС и ГОГАТ, По сравнению с ГС и ГОГАТ из микроорганизмов и ряда высших растений (-/7?/////?, /га ,1976; Евстигнеева, 1988) у пшениш эти ферменты изучены недостаточно. Можно указать лишь работы В.Л.Кретовича с сотрудниками (Крето-вич, Евстигнеева, 1949; К{5етович, Яковлева, 1959), исследовавших биосинтез глутамина в проростках пшеницы и созревающем колосе, затем работу Стрсйта и Феллера ( Stre/f, Tv/If , 1983),
которые показали наличие двух форм ГС в листьях пшеницы, а также работы Е.В.Быковой (1387) и Н.Д.Алехиной с сотрудниками (1984, 1986) по изучению ГС из корней пшеницы. В отношении ГОГАТ пшеницы известна лишь одна работа, посвященная изучении ферредоксинэависимой ГОГАТ (Фд-ГОГАТ) из листьев пшеницы ( Zheng, Tbngr ,1987). Все вышесказанное предопределило постановку данной работы.
Целью работа явилось изучение ГС и ФдгГ0ГАТ из листьев псенкш. В задачи работы гходило:
-
Разработать метод очистки и ьолучать в гомогенном состоянии наиболее активную - хлоропластную форму 1С листьев пшеницы, изучить ее структуру, кинетику и регуляці'..}.
-
Разработать метод очистки Фд-ГОГАТ из листьев пшеницы и на очищенном препарате определить наиболее важные кинетические параметры.
-
Изучить распределение по органам растений пшеницы активностей основных ферментов ассимиляции азота в процессе вегетации
-
Исследовать вопрос, о наличии согласованности в индукции синтеза ГС и Їд-ГОГАТ в листьях пшеницы.
Научная човиэна работы. В результате проведенных исследований обнаружено наличие двух форм ГС в листьях пшеницы: гито-зольноіі и хлоропластной. Разработан метод очистки хлоропласт-ной ГС.
Установлено, что хлоропластная ГС является олигомерным ферментом, состоящим из 8 идентичных мономоров с молекулярной массой 53 000 Да, для которых впервые изучены физико-химические и кинетические характеристики.
Показано наличие регуляции ГС хлоропластов листьев цевницы по принципу отрипатвлнюй обратной связи рядом аминокислот.
Разработан метод -частичной очистки 1>д-Г0ГАТ из листьев пшеницы и определены некоторые кинетические параметры фермента Обнаружено, что активность ключевых ферментов азотного обмена нитратредуктазы(НР), ГС, ГДГ, Фд-ГОГАТ на всем протяжении веге таиии коррелирует с дозой азотных удобрений, вносимых в почву, что создает благоприятные условия для усвоения; минерального азота яровой пшеницей. Исследовано распределение активности этих ферментов по органам растений пшеницы и показано, что ак-
тивность ГС намного выше, чем активность Фд-ГОГАТ и ГДГ. Наличия согласованности в регуляпии синтеза 1С и Фд-ГСГАТ рядом азотсодержащих f-етаболитов не обнаружено.
Практическая ценность работы. Полученный экспериментальный материал расширяет и углубляет общие представления для понимания процесса усвоения неорганического азота ппенипеЯ. Обнаруженная зависимость между содержанием азота в почве л активностью ключевых ферментов азотного обмена в растениях таениш может служить показателем интенсивности процесса усвоения азота. Результаты работы могут быть использованы для разработки методов повышения белковости зерна пшеницы..
Апробагтя работы. Основные положения диссертации доложены на совместном заседании лаборатории метаболизма азота и биосинтеза белка и группы энзимологии ассимиляции аммиака Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы, I работа сдана в печать.
Структур и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов а списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 ' рисунками, 10 таблицами и 2 схемами. Список литературы включает 178 наименований.
' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ .
I. Опытный матечичл. В качестве объекта исследования была использованы растениг пшеницы ( Trit/cum oestivi/m L ) двух сортов: яровая "Московская 35" и яровая "Казахстанская 4". В вегетационных опытах при выращивании на двух различных уровнях азота использовали яровую пшеницу сорта "Московская 35". Для всех остальных исследований использовалась яровая пшеница сорта "Казахстанская 4".
Проростки.пшенчцы выращивали в условиях оранжереи. В работе использовались 10-дневные проростки. В опытах по изучению активности основных ферментов ассимиляции азота в процессе вегетации на двух уровнях азотного питания, выращивание растений проводили в вегетационных сосудах во Всесоюзном научно-исследо-
вательском институте удобрений и агропочвоведения им. Д.Н. Прянишникова. Азот вносили в форме Са^Оз^ дробно. Количество азота, внесенное в сосуд, к урожаю составляло при недостат ке азота 0,2 г, а при высоком его уровне 1,5 г.
Для получения ферментных экстрактов замороженные в жидком азоте образцы разрушали растиранием их в ступке. Экстракцию проводили двумя восовіми частями буфера следующего состава: в случае очистки ГС - 5ы« трис- НСІ с рН 7,4, 2м.'.1 ЭДТА, 2м..' 2 - меркаптоэтанола; в случае очистки Фд-ГОГАТ - 50мМ ка-лнЕ-фосфатный буфер с рН 7,5, ЮОмМ НСІ, Бы1.1 ЭДТА, 0,1 2 -меркаптоэтанола.
2. Методы исследования.
. Определение активности глутаминсинтетазы проводили методом Эллиота ( flUott ,1953), основанием на количественном измерении f -глутамилгвдроксаыата ( /*- ГТК), и трансфераз-нш методом ( Sha/>iro, Stac/-fm»nt 1970).
Определение активности тлутаматдегидоогеназы проводила спектрофотометричаски по образованию НАД"*" (Гильманов, 1981).
Определение активности НАДН-РОГАТ проводили спектрофот метрическим методом, по образованию НАД* .( /fl&'/fc* Jtoaff/nos, 1972).
Активность Фд-ГОГАТ определяли по образованию L. -глута мата по методу ( ГПаїоА et7., 1980).
Определение актаМ'.)"ти HP проводили по Мульдору ( Ерма ков, 1987).
За единицу активности принимала количество фермента, ка тализирущее образование Імкмоля определяемого вещества за I минут. Удельную активность виражали числом единиц активности на I мг белка.
. Аналитический электрофорез проводили в 7,5, полиакрил-амадном геле по методу Дэвиса ( J>av/s , IS64).
Молекулярную массу олигомера ГС определяли методом гелі фильтрации на колонке с Тоуо/>ео^1 - Н^бЗ.
Молекулярную массу мономера ГС определяли методом электрофореза в 105-« полнакриламидном геле в присутствии доце-дилсульфата натрия (Webert OiLom, Г959).
Белок определяли по методу Лоури ( Lowryel о/. , I95I1
Содержание аммиака, определяли по Нвсслеру в ыодвфвка-
дии Любимова ^Любимов и др., 1968).