Глутаминсинтетаза мозга человека в норме и при шизофрении Терешкина, Елена Борисовна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Одной из нейрохимических гипотез патогенеза шизофрении, привлекающей в последнее время внимание исследователей, является "гипоглутаматергическая гипотеза" о нарушении функционирования глутаматного нейромедиаторного пути при этом заболевании. В основу гипоглутаматергической гипотезы были положены следующие факты: фенциклидин, антагонист глутаматных NMDA-рецепторов, способен провоцировать у добровольцев позитивные и негативные расстройства, характерные для шизофрении [Halberstadt,1995]; в аутопсийных образцах мозга больных шизофренией обнаружены следующие биохимические нарушения: число NMDA-рецепторов в лобной коре и базальных ганглиях увеличено [Akbarian et al.,19?6, Olney et al.,1995, Heresco-Levy et al.,1998]; экспрессия генов переносчика глутамата -ЕААТ2, локализованного в астроцитах, и метаботропных глутаматных рецепторов 3 и 5 в лобной коре снижена; в гиппокампе снижена экспрессия генов He-NMDA-глутаматных рецепторов GIuRl и GluR2 [Ohnuma et al.,1998]; концентрация глутамата в лобной коре, гиппокампе и в спинномозговой жидкости понижена [Tsai et al.,1995].

Измененный метаболизм глутамата, приводящий к нарушениям глутаматной нейромедиаторной системы в мозге при шизофрении, может быть обусловлен не только нарушением процессов его захвата переносчиками и его связывания со специфическими рецепторами, но и нарушениями в функционировании ферментов, участвующих в биосинтезе и превращении глутамата. Глутамат - один из возбуждающих нейромедиаторов - высвобождается нейронами в синаптическую щель, откуда поглощается окружающими астроцитами. В астроцитах глутамат превращается под действием глутаминсинтетазы (ГС, КФ 6.3.1.2.) в глутамин. Образовавшийся глутамин может захватываться глутаматергическими нейронами, в которых под действием фосфат-активируемой глутаминазы превращается в глутамат и пополняет таким образом нейромедиаторный пул. Такнм образом, ГС играет центральную роль в функционировании глутамат/глутаминового цикла в нервной системе.

ГС мозга человека практически не изучена, тем более при патологии нервной системы. В литературе имеются противоречивые данные об изменении активности и содержания ГС при болезни Альцгеймера. В то же время, авторы предполагают, что появление при болезни Альцгеймера и отсутствие в норме ГС в спинномозговой жидкости, а также измененный уровень активности ГС дают возможность считать ГС потенциальным ранним прижизненным диагностическим маркером этого заболевания [Tumani et al.,1995, Gunnersen et al.,1992]. ГС при шизофрении не изучалась. В связи с гипоглутаматергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение ГС при этом заболевании представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является оценка возможного участия ГС в нарушении метаболизма глутамата при шизофрении. В задачи исследования входило:

1. Выделение ГС из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или неврологическими заболеваниями.

2. Характеристика физико-химических свойств ГС.

3. Сравнительная оценка уровня активности ГС в экстрактах белков различных областей мозга человека в норме и при шизофрении.

4. Получение поликлональных антител к ГС мозга человека.

5. Разработка способа определения содержания ГС с использованием полученных антител.

6. Сравнительное изучение содержания ГС в мозге в норме и при
шизофрении.

Научная новизна работы. В работе предложен метод выделения ГС из мозга человека, позволяющий снизить инактивацию и увеличить выход фермента по сравнению с методами, известными по данным литературы [Yamamoto et al., 1987, Tumani et al., 1995]. Впервые в мозге обнаружен и выделен белок, подобный ГС по ферментативной активносги и иммунореактивности, названный "белком, подобным глутаминсинтетазе" (ГСПБ). Установлено, что трансферазная активность ГС, измеряемая в экстрактах белков мозга, является суммарной активностью ГС и ГСПБ.

Охарактеризованы биохимические свойства ГС мозга человека и впервые - ГСПБ. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка (ИЭТ) субъединиц ГС и ГСПБ различны - 44±1 кДа, ИЭТ 6,4-6,7 для ГС и 54±1 кДа, ИЭТ 5,9-6,2 для ГСПБ. Для ГС и ГСПБ определены зависимости скорости ферментативной реакции от рН, от концентраций ионов Мп²⁺ и Mg ⁺; определены Кп для глутамина; изучено влияние ингибитора L-метионин-Б-сульфоксимина в различных концентрациях на скорость ферментативной реакции.

Установлено, что ГС мозга и печени человека имеют гомологичные участки аминокислотной последовательности. Единственный просеквенированный декапептид ГСПБ не имеет гомологии с белками, содержащимися в базе данных SwissProt.

Получены поликлональные антитела к ГС и к ГСПБ мозга человека. Установлено, что эти антитела, как и моноклональные антитела к ГС (Chemicon, США) дают перекрестную реакцию с ГС и ГСПБ в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). Таким образом, иммунореактивность, выявляемая в экстрактах белков мозга методом ИФА, представляет собой суммарную иммунореактивность ГС и ГСПБ. Для раздельного выявления ГС и ГСПБ предложен метод вестерн-иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала. Сравнительная оценка содержания иммунореактивных ГС и ГСПБ при шизофрении и в контрольных случаях в лобной, передней и задней

лимбической коре и коре мозжечка проведена с использованием этого метода. При этом установлено, что при шизофрении содержание ГСПБ повышено во всех исследованных областей мозга (р<0.01). Содержание ГС при шизофрении в лобной коре понижено (р<0.01), в задней лимбической коре - не изменено, тогда как в передней лимбической коре и коре мозжечка - повышено (р<0.01).

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые обнаружен в мозге и охарактеризован белок, обладающий способностью катализировать реакцию, сходную с реакцией, катализируемой ГС. Разработан метод выделения ГС и ГСПБ из мозга человека и охарактеризованы физико-химические свойства этих белков. Выявлено изменение содержания ГС и ГСПБ в мозге при шизофрении по сравнению с контролем. Результаты исследовании могут быть использованы при изучении метаболизма одного из медиаторов нервной системы - глутамата и при изучении патогенеза шизофрении.

Основные положения, выносимые на защиту.

6. Впервые в мозге обнаружен, выделен и охарактеризован белок, подобный глутаминсинтетазе по ферментативной активности и иммунореактивности - ГСПБ.

7. Разработаны методы выделения ГС и ГСПБ из мозга человека.

8. Трансферазная активность, характерная для ГС и определяемая в экстракте белков мозга человека, представляет собой суммарную активность по меньшей мере двух ферментов - ГС и ГСПБ, и ее уровень в лобной, лимбической коре и коре мозжечка не изменен при шизофрении по сравнению с нормой.

4. Предложен способ определения содержания ГС и ГСПБ в
экстрактах белков мозга. В основу метода положены электрофйрез в ПААГ
с ДС-Na, вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением
сигнала, сканирование на лазерном денситометре.

5. Содержание ГСПБ в лобной, передней и задней лимбической коре
и коре мозжечка повышено при шизофрении по сравнению с контролем
(р<0.01). Содержание ГС при шизофрении в лобной коре понижено
(р<0.01), в задней лимбической коре - не изменено, в передней
лимбической коре и коре мозжечка - повышено (р<0.01).

Апробация диссертационного материала.

Результаты исследования были доложены на: 6-th World Congress of Biological Psichiatry (Nice, France, 1997); Международном Симпозиуме "Структура, стабильность и фолдинг белков" (Институт биохимии им. Баха РАН, Москва, 1998); 12-th General Meeting of the European Society for Neurochemistry (St.Peterburg, Russia, 1998); конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга" (НИИ Мозга РАНМ, Москва, 1999г.); 7-th International Congress on

Schizophrenia Research, Santa Fe, USA, 1999); 10-th Biennial Winter Workshop on Schizophrenia (Davos, Switzerland, 2000); на межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН "Прогресс в области биологической психиатрии",' посвященной памяти М.Е.Вартаняна (2000 г), на межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН 2000 г.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на (^страницах и состоит из 6 разделов, включающих введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов и указатель литературы. Обзор литературы посвящен исследованиям одного из ферментов метаболизма глутамата - глутаминсинтетазы - в мозге в норме и при психической патологии, изложена гипоглутаматергическая гипотеза патогенеза шизофрении. Библиографический указатель состоит из /и таблицами/"^,