Введение к работе
Представители семейства малых белков теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) обнаружены практически у всех живых организмов. Все представители этого семейства содержат в своей структуре так называемый а-кристаллиновый домен [1], состоящий из 6-8 антипараллельных Р-складок и играющий важную роль в формировании димеров. Характерными признаками малых белков теплового шока также являются небольшая молекулярная масса мономеров (от 12 до 43 кДа), склонность к формированию крупных олигомеров с молекулярной массой до 1 МДа [2, 3], динамичная четвертичная структура и шапероноподобная активность, проявляющаяся в способности sHsp предотвращать агрегацию частично денатурированных белков [3, 4]. Считается, что основной функцией sHsp является защита клеток от накопления агрегатов неправильно свернутых и денатурированных белков, образующихся под действием различных неблагоприятных факторов (тепловой шок, окислительный стресс, действие тяжелых металлов и других). Помимо этого, малые белки теплового шока принимают участие во многих других процессах, таких как апоптоз, пролиферация клеток, регуляция сократительной активности. Вероятно, именно из-за многофункциональности малых белков теплового шока точечные мутации этих белков зачастую сопровождаются развитием различных наследственных заболеваний [5].
В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока [5]. Некоторые sHsp человека экспрессируются повсеместно (HspB1, HspB5, HspB6 и HspB8), в то время как другие экспрессируются только в определенных тканях. Малые белки теплового шока человека склонны к образованию олигомеров различного размера и состава. Из-за сходства первичных структур они могут образовывать как гомо- так и гетероолигомеры. При этом по данным из лаборатории Бенндорфа оказалось, что HspB8 является универсальным белком-партнером, способным взаимодействовать практически со всеми малыми белками теплового шока человека [6, 7]. До последнего времени при исследовании взаимодействия и процессов формирования гетероолигомеров малых белков теплового шока использовались такие подходы, как коиммунопреципитация, двойная гибридизация в клетках дрожжей, или флуоресцентно-резонансный перенос энергии (FRET). Все эти методы предполагают использование модифицированных белков, содержащих дополнительные пептидные последовательности, или «химерных» белков, состоящих из соединенных между собой малых белков теплового шока и флуоресцентных белков. Прикрепление подобных «меток» может значительно изменять свойства небольших по размеру и склонных к олигомеризации малых белков теплового шока, приводя к получению ложно положительных или ложно отрицательных результатов. В этой связи представлялось целесообразным исследовать взаимодействие различных sHsp с использованием белков дикого типа или точечных мутантов этих белков, структура которых минимально отличалась бы от структуры нативных белков. Помимо этого, представлялось важным исследовать механизм формирования гомо- и гетероолигомеров sHsp и картировать участки, вовлеченные во взаимодействие между мономерами внутри таких олигомеров.
Цель и задачи работы. Целью нашего исследования являлось изучение белок- белковых взаимодействий различных малых белков теплового шока при образовании гомо- и гетероолигомеров. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Получить малые белки теплового шока и их точечные «цистеиновые» мутанты в высокоочищенном виде.
-
Исследовать влияние точечных мутаций на структуру и шапероноподобную активность исследуемых sHsp.
-
С помощью различных методов исследовать образование гомо- и гетероолигомеров in vitro.
-
Исследовать взаимодействие малых белков теплового шока человека на клеточном уровне.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Седьмая Р-складка а-кристаллинового домена играет важную роль в формировании гомо- и гетеродимеров sHsp человека.
-
HspBl, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой с образованием гетероолигомерных комплексов, но при этом очень слабо взаимодействуют с HspB8.
-
При образовании гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока человека необходима диссоциация крупных олигомеров до мономеров. Ключевой стадией в этом процессе является взаимодействие мономеров различных sHsp и образование гетеродимеров.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы был
разработан подход для анализа взаимодействия малых белков теплового шока человека,
состоящий во введении остатка цистеина в участки, предположительно участвующие в
образовании контактов, и были получены так называемые «цистеиновые» мутанты четырех
sHsp. Установлено, что структура таких мутантных белков практически не отличается от
структуры белков дикого типа. «Цистеиновые» мутанты sHsp эффективно образовывали
дисульфидные связи в гомо- и гетеродимерах, что свидетельствует о том, что Р7-складка, в
которой расположен введенный остаток цистеина, принимает участие в образовании как
гомо-, так и гетеродимеров различных малых белков теплового шока человека. Эти результаты были подтверждены экспериментами, выполненными зарубежными учеными на изолированных а-кристаллиновых доменах HspB5 (aB-кристаллина) и HspB6 (Hsp20) методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [8-10]. С использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов различными методами было установлено, что HspBl, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой, в то же время они лишь очень слабо взаимодействуют с HspB8.
На основе полученных результатов предложена схема, описывающая предполагаемый механизм образования гетероолигомерных комплексов sHsp человека. В отличие от общепринятой точки зрения, постулирующей димер в качестве минимальной стабильной субъединицы малых белков теплового шока, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для образования гетероолигомерных комплексов необходимо наличие свободных мономеров. Предположительно, такие мономеры могут образовываться как за счет диссоциации крупных олигомеров, так и за счет диссоциации гомодимеров. Взаимодействуя между собой, мономеры образуют гомо- или гетеродимеры, которые, ассоциируя, формируют различные по размеру и составу гомо- или гетероолигомеры.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ; на 35-м Международном Конгрессе Европейских Биохимических Обществ (FEBS) в 2010 г. (Ґетеборг, Швеция); на Форуме молодых ученых и 12-й конференции Международного Союза Биохимиков и Молекулярных Биологов (IUBMB) в 2010 г. (Мельбурн, Австралия); на международной конференции «Биология Молекулярных Шаперонов» в 2011 г. (Грундлси, Австрия); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2008-2010 гг. (Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 5 статей и 6 тезисов сообщений.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 118 страницах печатного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы содержит 171 наименование.
Похожие диссертации на Гомо- и гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока человека
-
