Введение к работе
Актуальность проблемы
Ангиогенин - основной белок, индуцирующий рост сосудов in vivo , был вяёрвые выделен из клеток карциномы человека. Позднее ангиогенин был обнаружен в плазме крови здоровых людей. Экспрессию гена ангиогенина наблюдали как в нормальных, так и в опухолевых тканях человека и животных. Вопрос о роли ангиогенина в физиологических процессах в норме и патологии пока остается открытым, однако уже сегодня ангиогенин рассматривают как белок, потенциально значимый для лечения ран, ожогов, язв, обсуждается возможность его применения при некоторых' сердечно-сосудистых патологиях. Изучение регуляции экспрессии и механизмов действия ангиогенина, равно как и возможностей его медицинского применения сильно сдерживается незначительными количествами этого белка в природных источниках. Единственная возможность получения необходимых для медико-биологических испытаний количеств ангиогенина - создание его генно-инженерного продуцента.
Системы получения генно-инженерных белков постоянно совершенствуются, однако по настоящее "время практически отсутствуют универсальные схемы, позволяющие быстро и надежно получать белковый продукт, синтез которого направляется сконструированной рвкомбинантной ДНК. Универсальные системы особенно необходимы в практических лабораториях .где1, как правило, возникают задачи получения белка, а не исследования закономерностей его синтеза
в Е-со6'.
Цель и задачи работы
Целью настоящей работы является получение генно-инженерного ангиогенина человека посредством химико-ферментативного синтеза полноразмерного гена с последующей экспрессией его в E.co^i. При экспрессии синтетического гена предполагалось использовать системы с достаточным уровнем универсальности о тем, чтобы создать базу для дальнейшего получения генно-инженерных продуцентов биологически активных веществ белковой природы для
экспериментов по возможности их использования в практической медицине.
В соответствии с этим необходимо было решить следующие задачи:
-
разработка стратегии химико-ферментативного синтеза гена ангиогенина человека;
-
химико-ферментативный синтез гена ангиогенина человека и его клонирование в соответствии с разработанной стратегией;
-
анализ экспрессии синтетического гена ангиогенина в различных системах, характеризацш этих систем;
-
оценка биологической активности полученного генно-инженерного ангиогенина и его производных.
Научная новизна работы
В работе предложена новая схема сборки искусственных генов из блоков, впервые подучены слитые белки ангпогенин-л-пептид J, - галактозидазы її.соїг, уз-галактозидаза-ангиогенин, домены белка А-ангиогенин. Обнаружена ангиогенная активность слитого белка fi -галактозидаза-ангиогенин, продемонстрирована возможность специфического расщепления слитого белка кислотным гидролизом по связям Jsp'Pro. В процессе получения слитого белка домены белка А-ангиогензн обнаружена зависимость интенсивности внутриклеточного протеолиза белка от наличия сигнальной (лидерной) последовательности у этого белка.
Практическое значение. В результате проделанной работы получены бактериальные штаммы, продуцирующие ангиогенин в составе слитых белков. Разработаны схемы расщепления слитых белков. Создана база для начала экспериментов по оценке возможностей медицинского применения ангиогенина. Штаммы - продуценты слитых белков "j, -галактозидаза-ангиогенин" и "домены белка А-ангиогенин" переданы для среднемасштабного культивирования в ШО "Фермент" Минмедбиопрома (г. Вильнюс).
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988), на Ш двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Регуляция генома" (Иркутск, 1989), на семинаре Отдела биотехнологии
Королевского института технологий (Стокгольм, 1988). В 1988-1989 гг. работа была представлена на ВДНХ СССР и удостоена золотой медали. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, тезисы двух докладов, получено положительное решение на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах, включая 27 рисунков и I таблицу. Библиография содержит 144 наименования. Работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитированной литературы.