Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль пероксидазы в жизнедеятельности растений (обзор литературы) 8
1.1. Распространенность фермента пероксидазы, история его изучения и практическое значение 8
1.2. Строение и свойства растительной пероксидазы 11
1.2.1. Структура и физико-химические свойства 11
1.2.2. Реакции, катализируемые пероксидазой 14
1.3. Физиологические функции растительной пероксидазы 18
1.3.1. Полифункциональность растительных пероксидаз 18
1.3.2. Физиологические функции отдельных изопероксидаз в растениях... 20
1.3.3. Функции пероксидаз, связанные с защитными реакциями растений на инфицирование патогенами 21
1.4. Биополимеры, входящие в состав клеточных стенок фитопатогенов и взаимодействие растительных пероксидаз с ними 24
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Объекты исследований 32
2.2. Постановка опытов 33
2.3. Получение ферментных экстрактов свободной, ионно- и ковалентно-связанной с клеточными стенками фракций пероксидазы, а так же её внеклеточных форм 34
2.4. Подготовка хроматографических матриц 35
2.5. Выделение пероксидаз, способных сорбироваться на хитин 36
2.6. Определение активности ферментов 37
2.7. Колориметрический метод определения белка по Bradford 37
2.8. Методы электрофореза белков 37
2.9. Иммунологические методы 39
2.9.1. Получение поликлональных антипероксидазных антител 39
2.9.2. Двойная иммунодиффузия в агарозном геле 40
2.9.3. Определение концентрации анионной пероксидазы методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа 40
2.9.4. Вестерн-блоттинг 41
2.10. Статистическая обработка результатов 42
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 43
3.1. Сорбция пероксидаз на клеточные стенки фитопатогенных грибов и ризобиальных бактерий 43
3.1.1. Взаимодействие пероксидаз пшеницы с хитин-глюкановым комплексом клеточных стенок фитопатогенных грибов 43
3.1.2. Взаимодействие пероксидаз из корней козлятника восточного с клеточными стенками ризобиальных бактерий 45
3.2. Выделение гомогенного препарата хитин-специфичной пероксидазы пшеницы и изучение её свойств 48
3.2.1. Исследование механизмов сорбции пероксидазы пшеницы на хитин 48
3.2.2. Локализация хитин-специфичной пероксидазы в растениях пшеницы 50
3.2.3. Получение гомогенного препарата анионной пероксидазы пшеницы 52
3.2.4. Характеристика хитин-специфичных белков пшеницы 54
3.2.5. Иммуноспецифичность антител, полученных против анионной пероксидазы и хитин-специфичных белков пшеницы 56
3.3. Взаимодействие пероксидаз различных видов растений с хитином 58
3.3.1. Влияние хитина на активность пероксидазы в белковых экстрактах из различных видов растений 58
3.3.2. Изоферментный состав пероксидаз разных видов растений 60
3.3.3.Исследование иммунохимического сходства пероксидаз разных видов с хитин-специфичными белками пшеницы 67
3.4. Влияние хитоолигосахаридов, салициловой кислоты и освещения на устойчивость каллусов пшеницы к возбудителю твердой головни 70
3.4.1. Изменение активности и изоферментного спектра пероксидазы в совместных культурах каллусов Т. aestivum с грибом Т. caries под влиянием хитоолигосахаридов 71
3.4.2. Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов Т. aestivum с Т. caries 80
3.4.3. Влияние освещенности на активность пероксидазы пшеницы в совместных культурах каллусов Т. urartuw Т. caries 88
Заключение 92
Выводы 96
Список литературы 97
- Структура и физико-химические свойства
- Функции пероксидаз, связанные с защитными реакциями растений на инфицирование патогенами
- Исследование механизмов сорбции пероксидазы пшеницы на хитин
- Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов Т. aestivum с Т. caries
Введение к работе
Актуальность исследований. Определение механизмов взаимодействия между молекулярными компонентами растений и патогенов, ведущих к формированию совместимых или несовместимых отношений между партнерами, является одной из наиболее актуальных задач современной биохимии. В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода (АФК), большое внимание стали уделять оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке [Hippeli et al., 1999; Droge, 2002]. Среди этого обширного класса ферментов особый интерес представляет пероксидаза, участвующая во многих биохимических реакциях, происходящих в живом организме [Савич, 1989; Passardi et al., 2004]. Основная функция этого фермента состоит в детоксикации перекиси водорода [Gechev et al., 2002] и окислении фенольных соединений с образованием лигнина и суберина [Hawkins, Boudet, 2003; Kawano, 2003], однако роль отдельных изопероксидаз в биохимических процессах, происходящих в растениях, до конца не ясна.
Активность пероксидазы коррелирует с развитием устойчивости растений как к абиотическим, так и биотическим стрессам. Лигнификация, осуществляемая пероксидазой, играет чрезвычайно важную роль в защите растительных тканей от фитопатогенов. Образовавшийся при этом механический барьер ограничивает водный обмен и поступление питательных веществ в зону проникновения патогенных микроорганизмов [Denny et al., 2003]. К сожалению, не известно, какие силы формируют вокруг места инфицирования лигнин, и почему эта зона характеризуется активной генерацией АФК [Zhou et al., 2000; Heitefuss, 2001]. Существуют данные о лигнификации не только растительных тканей, но и гиф патогена [Milosevic, Slusarenko, 1996; Denny et al., 2003], хотя этот факт остается мало изученным. В нашей лаборатории ранее была выявлена способность анионной пероксидазы пшеницы с изоэлектрической точкой (pi) 3.5 к сорбции на хитин [Максимов, 1994] и показано ее участие в защитных реакциях растений против грибных патогенов [Хайруллин и др., 2000]. Раскрытие механизмов, лежащих в основе формирования устойчивости растений к болезням, является важным шагом в поиске путей ее повышения.
Цель данной работы состояла в изучении молекулярной гетерогенности пероксидазы, выделенной из разных видов растений, и механизмов взаимодействия её изоформ с компонентами клеточных стенок грибов.
Задачи исследований:
1. Определить распространенность среди различных видов растений изопероксидаз, способных связываться с хитином.
2. Определить возможность связывания растительных изопероксидаз с компонентами клеточной стенки фитопатогенных грибов.
3. Выделить анионную пероксидазу из проростков пшеницы и охарактеризовать биохимические механизмы ее связывания с хитином.
4. Получить антитела против анионной пероксидазы мягкой пшеницы и провести ее иммунологическое сравнение с белками из других видов растений.
5. Выявить механизмы вовлечения анионной пероксидазы в развитие индуцированных хитоолигосахаридами, салициловой кислотой и освещением защитных реакций каллусов пшеницы в совместной культуре с грибом Т. caries.
Научная новизна. Впервые из различных видов растений были выделены и охарактеризованы изопероксидазы, специфически взаимодействующие с хитином и мицелием патогенных грибов. Выявлено иммунохимическое сходство анионной пероксидазы пшеницы с белками из других видов растений. Изучена динамика активности пероксидазы и её изоформ различной локализации в каллусах пшеницы при их инфицировании возбудителем твердой головни и воздействии света, хитоолигосахаридов и салициловой кислоты.
Практическая значимость работы. Разработан способ выделения и очистки отдельных изоформ пероксидазы растений с использованием хитина и хитозана. Активация анионной пероксидазы в ответ на добавление индукторов устойчивости в среду культивирования совместных культур клеток пшеницы с возбудителем твердой головни может служить в качестве маркера для эффективного отбора препаратов с иммуностимулирующей активностью.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийских съездах общества физиологов растений (Пенза, 2003), общества биохимиков и молекулярных биологов (С.-Петербург, 2002), общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), конференции по иммунитету растений (С.-Петербург, 2002), «Актуальные проблемы биологии» (Сыктывкар, 1999), «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), «Молодые ученые Вол го-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), на международном конгрессе FESPB (Краков, 2004), Международных конференциях «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 2001; С.-Петербург, 2003), «Molecular Plant - Microbe Interactions» (С.-Петербург, 2003), «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001), «Геном растений» (Одесса, 2003).
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 01-04-48495) «Хитин-специфичные» пероксидазы как регуляторы интенсивности элиситорных сигналов при грибном патогенезе", РФФИ (№ 05-04-48310) «Хитин-специфичные» оксидоредуктазы в сигнальной регуляции устойчивости растений к фитопатогенным грибам», РФФИ-Агидель (№ 02-04-97923) «Совместные культуры клеток пшеницы с фитопатогенами как модель для скрининга средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами» и грантом №207 6-го конкурса экспертизы молодых ученых РАН «Активация анионных пероксидаз как показатель неспецифической ответной реакции пшеницы против фитопатогенных грибов».
Публикации. Список основных публикаций по материалам диссертации включает 18 работ, включающий 5 статей в рецензируемых журналах.
Структура и физико-химические свойства
Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового макроцикла с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы. Феррипорфирин, исполняя роль активного центра, участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов [Henriksen et al., 2001]. Присутствующий в пероксидазе ион железа обладает способностью не только активировать перекись водорода, но и сообщать ей способность вступать в реакции окисления различных субстратов. Источником активного кислорода при каталитическом действии пероксидазы могут служить также и органические перекиси.
Протопорфирин оказывает важное стабилизирующее влияние на белковую глобулу ферментов. Так, комплексообразование апопероксидазы хрена с гемином резко повышает устойчивость белка к действию ультрафиолета и тепла. Связь протогема с апоферментом обеспечивается также солевым мостиком между остатком пропионовой кислоты и одним из аминокислотных остатков белка. Нарушение этих связей значительно снижает каталитическую активность. Под действием низких значений кислотности молекула нативной пероксидазы распадается на гем и апобелок, теряя при этом свои ферментативные свойства [Газарян, 1992]. Однако в последнее время появились работы, свидетельствующие о существовании пероксидаз, сохраняющих свою стабильность и при рН менее 2.8. Предполагается, что это становится возможным благодаря близости расположения остатков аргинина (Arg-38) и гистидина (His-42) у входа в их активный центр и конформационному переходу, который претерпевают их молекулы при низких значениях кислотности в присутствии Са +, в результате чего субстрат-связывающий канал закрывается [Газарян и др., 1998; Сахаров, 2004].
В большинстве случаев пероксидаза функционирует в виде мономера, в состав которого, кроме гема, входят два иона Са2+, обеспечивающие, по мнению некоторых авторов, термическую стабильность фермента [Иванова, Рубин, 1962; Газарян и др., 1998]. Однако есть сведения о существовании ди- и тетрамерных форм, причем их активность выше, чем у мономерной формы [Садвакасова, Кунаева, 1987].
Молекулярная масса фермента в зависимости от изоформы и объекта исследований варьирует от 10 до 60 кДа [Андреева, 1988]. Различия в качественном и количественном составе Сахаров и аминокислот обуславливают существование множества изоформ пероксидазы [Vandenberg, van Huystee, 1984]. Shannon с соавторами [1966] одними из первых разделили пероксидазу из корней хрена на 5 форм, различающихся по содержанию оксипролина и ароматических аминокислот.
В первичную структуру белка этого фермента может входить от 203 до 300 аминокислотных остатков [Welinder, 1992]. Полная аминокислотная последовательность для изофермента С пероксидазы хрена, составляющем около 50 % всего спектра пероксидаз этого растения, была впервые опубликована Велиндером в 1976 году. Обнаружено, что даже в одном растении пероксидазы, различающиеся по pi, отличаются по аминокислотному составу. Таким образом, пероксидаза обладает высокой молекулярной гетерогенностью и имеет множество изоформ [Hiraga et al., 2001]. Строго говоря, изоэнзимы - это разные молекулярные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но разделяющиеся физико-химическими и иммунохимическими методами. Изоферменты подразделяется на кислые (анионные), с рі в зоне менее 5.5, нейтральные с pi от 5.5 до 7.5 и щелочные (катионные), с pi более 7.5. Анионные изоформы содержат много глутаминовой кислоты (или глутамина), серина и метионина, а в катионные -больше гистидина, аргинина и пролина [Газарян, 1992]. Было обнаружено, что очень консервативная область молекулы пероксидазы между 34-м и 58-м аминокислотными остатками осуществляет такие функции, как присоединение гема, каталитическое взаимодействие с перекисью водорода и, вероятно, участие в пептид-пептидных контактах [Welinder, 1992].
Являясь гликопротеинами, пероксидазы могут содержать до 25% нейтральных и аминосахаров, что, однако, не исключает наличия и негликозилированных форм фермента [Газарян, 1998]. В составе углеводов идентифицированы галактоза, глюкоза, манноза, арабиноза, ксилоза, фруктоза и гексозамины [Klapper, Hackett, 1965]. Показано, что удаление олигосахаридов пероксидазы снижает термостабильность фермента в несколько раз [Газарян, 1992], но повышает его устойчивость действию протеаз [Tadors et al., 1983]. Кроме этого, предполагают, что углеводы облегчают прохождение фермента через мембрану и стабилизируют трехмерную структуру апобелка.
В зависимости от объекта и изоформы, пероксидаза характеризуется специфическим пиком поглощения в области света длиной волны от 400 до 408 нм, так называемая линия Соре [Иванова, Рубин, 1962]. Ещё одной важной специфической характеристикой фермента является величина RZ - отношение оптической плотности при длине волны, соответствующей пику поглощения гема (403 нм), к оптической плотности при 280 нм - отражающая степень чистоты гемопротеина. Величина RZ в зависимости от объекта может варьировать довольно в широких пределах. Так, например, из культуры фасоли выделены пероксидазы с величиной RZ 3.08 (ВР1) и 1.40-1.94 (ВРИ) [Газарян, 1992]. В основе механизма действия пероксидазы лежит ее способность взаимодействовать с Н2О2 с образованием промежуточных комплексов и тем самым, за счет кислорода перекиси, катализировать окисление химических соединений. В настоящее время насчитывают четыре таких комплекса. I комплекс образуется сразу после добавления перекиси и обычно превращается в комплекс II; комплексы III и IV представляют соединения, образующиеся при избытке перекиси (рис. 2) [Passardi et al., 2004].
Одной из особенностей этого фермента является его чрезвычайно широкая субстратная специфичность. Н.Н. Угарова и О.В. Лебедева [1996] объясняют это наличием нескольких механизмов электронного транспорта выполняемого с участием этого фермента. Субстраты первой группы (неорганические ионы) взаимодействуют непосредственно с гемом. Субстраты второй группы (ароматические амины и фенолы) непосредственно с гемом не реагируют. Субстраты-доноры водорода окисляются пероксидазой значительно быстрее, чем доноры электронов. Для объяснения механизма действия пероксидазы в реакциях с субстратами-донорами электронов используется модель, в которой этот фермент представляется белком-проводником, реализующим несколько каналов транспорта электронов с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема [Рогожин, Рогожина, 2003]. Индивидуальные изопероксидазы различаются по субстратной специфичности, что вероятно, обусловлено изменением заряда и конфигурации как фермента, так и субстрата при различных значениях рН. Например, анионные пероксидазы имеют более высокую специфичность к о-фенилендиамину, люминолу, диаминобензидину, к 2.2-азино-бис-З-этилбензтиозалин-6-сульфоновой кислоте, а катионные - к гваяколу, фенол-антипирину, пирогаллолу [Газарян, 1998].
Функции пероксидаз, связанные с защитными реакциями растений на инфицирование патогенами
Работы проводились на представителях различных видов однодольных и двудольных растений. Класс Однодольные {Monocotyledones) . из семейства Роасеае — пшеница мягкая {Triticum aestivum L.), овёс посевной {Avena sativa L.), рис культурный {Oryza sativum L.) и кукуруза {Zea mays L.), из семейства Liliaceae - лилия царственная {Lilium regale Wils.), хоста {Hosta glaucd) и алое {Aloe vera L.), из семейства Alliaceae - лук репчатый {Allium сера L.), лук-порей {Allium porrum L.), чеснок посевной {Allium sativum L.). Класс Двудольные (Dicotyledones): из семейства Brassicaceae - хрен деревенский {Armoracia rusticana Gaertn., Mey. et Schreb), капуста белокочанная {Brassica oleraceae var. capitata L.) и редис посевной {Raphanus sativus var. radicula), из семейства Fabaceae - горох посевной {Pisum sativum L.), арахис подземный {Arachis hypogaea L.) и козлятник восточный {Galega orientalis Lam.), из семейства Cucurbitaceae - огурец посевной {Cucumis sativus L.), тыква лагенария {Lagenaria siceraria (Мої.) Standi.) и кабачок {Cucurbita pepo L. var giromontia Duch.), из Solanaceae - табак курительный {Nicotiana tabacum Link et Otto), петуния садовая {Petunia hybrida Vilm.) и картофель {Solanum tuberosum L.). В отдельных опытах использовали растения пшеницы (род Triticum L.) разного возраста.
Семена и растения получали из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства (ВИР) им. Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург), в Чишминском опытном хозяйстве Башкирского НИИ сельского хозяйства (Чишмы, Башкирия) и Ботаническом саду-институте УНЦ РАН, за что автор выражает глубокую благодарность сотрудникам этих учреждений.
Каллусы мягкой пшеницы (Triticum aestivum) сорта Жница и их совместных культур с грибом Т. caries были любезно предоставлены к.б.н. Суриной О.Б. В качестве индукторов устойчивости использовали салициловую кислоту (СК, «Реахим», Россия) и хитоолигосахариды, полученные к.б.н. Ахметовой И.Э.
Мицелий и споры фитопатогенных грибов-возбудителей твердой головни (Tilletia caries (DC.) Tul.), пыльной головни (Ustilago tritici), септориоза (Septoria nodorum Berk.) и гельминтоспориоза {Bipolaris sorokiniana) были отобраны из коллекции лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук (ИБГ УНЦ РАН). Штаммы симбиотических бактерий Rhizobium galegae, СІАМ 0702 и СІАМ 0716, были получены из коллекции микроорганизмов Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биологии г. Пушкин (Санкт-Петербург) и любезно предоставлены для работы с.н.с. лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИБГ УНЦ РАН А.Х. Баймиевым. Опыты проводили в лабораторных условиях, где растения выращивали при комнатной температуре (20-22 С) на светоплощадке с 16-ти часовым светопериодом, освещенностью 12-16 тыс. лк (лампы ЛД-4, ЛБ-40). Семена стерилизовали 80%-ным этанолом (3 мин) и промывали стерильной водой. В зависимости от цели опыта и необходимого возраста растений семена проращивали в горшках с речным песком в смеси (1:1, г/г) с почвой или в эмалированных кюветах на влажной фильтровальной бумаге. Субстраты предварительно автоклавировали. Водные растворы ХОС или СК добавляли в питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) перед её стерилизацией. Конечные концентрации ХОС в средах культивирования составляли 0.01 мг/л, 1 мг/л и 100 мг/л, а СК - 7 мг/л (0.05мМ). Спустя 4 сут после посадки каллусов на МС, содержащую и не содержащую индукторы устойчивости, их инфицировали телиоспорами T.caries. Фиксацию производили на 4, 7, 10, 13 сут культивирования или 0, 3, 6, 9 сутки после инфицирования. В отдельном опыте каллусы выращивали также как и растения на светоплощадке с 16-ти часовым светопериодом. Получение ферментных экстрактов свободной, ионно- и ковалентно-связанной с клеточными стенками фракций пероксидазы, а так же её внеклеточных форм. Для выделения анионной пероксидазы растительный материал из 4-х сут проростков пшеницы предварительно измельчали в жидком азоте, заливали ацетоном (-20 С) и экстрагировали пигменты и липиды до обесцвечивания экстрагента, который удаляли центрифугированием. Затем порошок быстро сушили в токе воздуха при комнатной температуре [Hamilton et al., 1976]. Ферментные экстракты свободно-растворимой (цитоплазматической), ионно- и ковалентно-связанной с клеточной стенкой растений пероксидаз получали по методике Bireska и Miller [1974]. Для получения свободно-растворимой фракции белков полученный ацетоновый порошок гомогенизировали в 0.01 М Na-фосфатном буфере (ФБ) рН 6,2 (ФБ) (1:10) и экстрагировали белки при 4 С, в течение 1 часа. Затем гомогенат центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин на центрифуге «high speed centrifuge type 310 b (Mechanica precyzyjno) Poland». Для выделения ионно-связанной фракции пероксидазы клеточные стенки каллусов пшеницы, после их 10-и кратного отмывания ФБ содержащим 1 % тритон Х-100 (1CN) (отношение масса навески: объем ФБ - 1:10), подвергались обработке 2 М NaCl в ФБ (отношение масса навески: объем буфера - 1:1). Образцы центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин на центрифуге «high speed centrifuge type 310 b (Mechanica precyzyjno) Poland» и супернатант диализовали против ФБ. Ковалентно-связанные с клеточными стенками изопероксидазы выделялись после отмывки от ионно-связанных фракций белка ФБ с применением 0.25 % целлюлазы и 0.25 % пектиназы (Onozuka, Япония) в ФБ. Все образцы перед анализами подвергались диализу против ФБ. Выделяемые каллусами пшеницы в среду культивирования внеклеточные пероксидазы извлекали из неё с использованием 2 М NaCl в ФБ. Хитин крабов размалывали на зерновой мельнице и просеивали. Фракцию с размером частиц 125 - 200 мкм для освобождения от минеральных примесей суспензировали в 2 М НС1 при комнатной температуре, а через 2 часа промывали дистиллированной водой. От примесей белков хитин освобождали нагреванием с 1н NaOH на водяной бане до 96 С в течение 30 мин при 5-6 сменах щелочного раствора. После этого сорбент промывали водой до нейтрального значения рН. Затем обрабатывали дважды 96%-м этанолом и осадок высушивали. Полученный хитин имел зольность меньше 0.1% и степень дезацетилирования около 15%. Хитозан - полностью дезацетилированный хитин - получали, обрабатывая хитин 40%-ным NaOH при 110 С в течение не менее 7 часов. Полученный хитозан отличался от исходного хитина растворимостью в 100 мМ уксусной или 50 мМ соляной кислоте. Для получения хитина со степенью ацетилирования (СА) 12, 23, 37, 45, и 65% реакцию дезацетилирования останавливали в течение 1, 3, 4, 6 часов. СА хитина определяли потенциометрическим методом [Плиска и др., 1977]. Затем полимер промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции рН и высушивали. Для проведения жидкостной колоночной хроматографии полученный хитин с различной СА суспензировали в дистиллированной воде, заполняли им колонку (2x6 см), которую потом уравновешивали против 0.1 М ФБ. Хитин-глюкановый комплекс из спор и мицелия различных фитопатогенных грибов получали согласно рекомендациям [Феофилова, 2002]. Для получения мицелия споры грибов проращивали на агаре Чапека с глюкозой ("Реахим", Россия) (Т. caries - в течение семи дней при 18 С, a S. nodorum и В. sorokiniana - 24 ч) и смывали с агара 0.1 М ФБ. Промытый водой и высушенный грибной мицелий измельчали и тщательно промывали дистиллированной водой, затем выдерживали в горячей воде (98 С) с добавлением 0.02% ЭДТА и 1% этанола в течение 1 ч при помешивании.
Исследование механизмов сорбции пероксидазы пшеницы на хитин
Ранее в нашей лаборатории была показана способность анионной пероксидазы пшеницы связываться с хитином в 100 мМ ФБ [Максимов и др., 1995; Хайруллин и др., 2000] и десорбироваться с него раствором NaCl высокой ионной силы. Эти результаты позволяют предположить, что связывание анионной пероксидазы с хитином определяется ионной силой раствора. Тем более что благодаря наличию у этого биополимера свободных аминогрупп, давно известны его анионообменные свойства [Sugavara et al., 2000]. Проверка этого предположения была проведена с использованием различных концентраций буфера и NaCl (рис. 9 а, б). Повышение концентрации буфера или соли в среде сопровождалось параллельным возрастанием степени десорбции ферментов с сорбента, что говорит о зависимости связывания этого фермента с хитином от ионной силы растворов.
Как известно, в составе клеточной стенки грибов помимо хитина, часто обнаруживается его дезацетилированное производное - хитозан [Феофилова, 1983]. Можно предположить, что из-за увеличения количества свободных аминогрупп при деацетилировании хитина, будет возрастать степень взаимо действия анионной пероксидазы с хитозаном, поскольку ее заряд отрицательный, а хитозан обладает катионообменными свойствами. Для проверки зависимости сорбции белков пшеницы с пероксидазной активностью от степени ацетилирования хитина, была проведена колоночная хроматофафия с использованием хитина со С А 12, 23, 45, и 85%. Условия хроматофафии совпадали с описанными в методической части работы. Обнаружено, что на 1 г воздушно-сухой массы хитина со СА 85% сорбируется 4.6 мг хитин-специфичных белков; на хитин со СА 45% - 2.33 мг; со СА 23% — 1.2 мг, а со СА 12% - 0.5 мг, что коррелирует с данными по влиянию степени ацетилирования хитина на сорбцию пероксидазы (рис. 9, в). Снижение степени ацетилирования хитина приводило к ослаблению взаимодействия фермента с ним. Следовательно, при сорбции анионной пероксидазы пшеницы на хитин значительную роль играют специфичные участки в белковой молекуле, связанные с преимущественным взаимодействием с ацетильными остатками хитина, а не с зарядом фермента. Это свойство анионной пероксидазы пшеницы позволило назвать её хитин-специфичной изоформой. Основываясь на способности анионной пероксидазы сорбироваться на высоко ацетилированный хитин, мы предположили, что она будет активно связываться и с другим полимером, содержащим ацетильные группы, например, с ацетил целлюлозой. Для выявления сорбции пероксидазы на целлюлозу и ацетил целлюлозу на поверхность ацетилцеллюлозных («Тасма», Россия) и целлюлозных («LKB», Швеция) фильтров наносили по 3 мкл образцов грубого экстракта пшеницы, белков, не связывающиеся с хитином и способных к сорбции на хитин. Через 5 мин фильтры погружались в 0.1 М ФБ рН 6.0 для отмывки от не связавшихся с биополимерами белков, затем проявлялись на наличие пероксидазной активности. Рис. 10. Сорбция пероксидазы пшеницы из полученных после хроматографии на хитине фракций белка на ацетилцеллюлозу: 1) грубый экстракт, 2) фракция не связывающаяся с хитином, 3) хитиновый элюент. Обнаружено, что на целлюлозный фильтр сорбции пероксидазы пшеницы не происходит, тогда как на ацетилцеллюлозе выявлялась сорбция пероксидазы из грубого экстракта и солевого элюента с хитина (рис.10). Следовательно, при сорбции пероксидазы пшеницы как на ацетилцеллюлозу, так и на хитин, решающую роль играют ацетильные группы полисахаридов. Известно, что спектр пероксидаз зависит от возраста растений и характеризуется определенной органоспецифичностью [Лебедева и др., 2003]. Например, у пшеницы при ИЭФ в ПААГ проявляется не менее 17 изоферментов, некоторые из которых могут с возрастом изменять свою активность и даже исчезать или появляться. Поскольку целью работы являлось выделение анионной пероксидазы пшеницы, первоначально важно было выявить возраст растений, когда наблюдается наибольшая ее экспрессия. В связи с этим, было проведен анализ изменения активности анионной пероксидазы с pi 3.5 в ходе прорастания семян пшеницы. Обнаружено, что наибольшим содержанием этого фермента характеризуются 4-х суточные проростки (рис. 11). Исследовалось распределение анионной пероксидазы в различных органах проростков пшеницы, который выявил их активность в корнях (рис. 12). Подобная закономерность наблюдалась и другими исследователями [Morimura et al., 1999]. Таким образом, для выделения пероксидазы с pi 3.5 лучше всего подходят корни 4-х сут проростков пшеницы. Кроме того, можно предположить, что если анионная пероксидаза содержится в корнях молодых проростков, контактирующих с почвенной микрофлорой, то одной из вероятных функций этой изоформы является участие во взаимоотношении с фитопатогенными грибами и защита клеток корня от фитопатогенов.
Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов Т. aestivum с Т. caries
Инфицирование приводит к изменениям в изоферментном спектре пероксидазы. В начальные фазы опыта в ионно-связанной с клеточными стенками фракции различий в активности пероксидазы между вариантами опыта не наблюдалось (рис. 40, А). Только после 10 сут совместного культивирования во фракции клеточных стенок каллусов пшеницы с грибом Т. caries, происходило достоверное повышение активности пероксидазы. К 20 сут после инфицирования, она превышала контрольные показатели в два и более раза, что особенно сильно проявлялось в варианте с СК. Во фракции ковалентно -связанных с клеточными стенками белков под влиянием СК появляются анионные изопероксидазы с pi 3.5, которые активируются и при инфицировании (рис. 40, Б). Причем в зараженных Т. caries каллусах пероксидазы могут не только концентрироваться в клеточно-стеночной фракции, но и выделяться в среду их культивирования. В культуральной среде инфицированных каллусов обнаруживаются анионные изопероксидазы с pi от 3.5 до 4.8, а также изопероксидазы с pi 7.5. Следует заметить, что отмеченные нами изоформы вовлекаются в защитные реакции растений. Активность анионных пероксидаз многократно повышается в проростках устойчивого сорта пшеницы, инфицированной возбудителем твердой головни или септориоза, в сравнении с восприимчивым [Хайруллин и др., 2000]. Пероксидаза пшеницы с pi 7.5 обладает антифунгальной активностью [Caruso et al., 2001], а пероксидаза с pi 4.8 активируется в растениях под воздействием АБК и активно проявляется в вариантах с инфицированием [Ахметова, 2000], что, вероятно, связано с повышенным содержанием этого фитогормона в инфицированных клетках [Ганиев, 2000]. Таким образом, хитин-специфичные анионные пероксидазы, многократная активация которых наблюдается под воздействием фитопатогена в цитоплазматической, клеточно-стеночной и внеклеточной зонах, с уверенностью можно отнести к PR-белкам. Проявление анионных пероксидаз в ионно-связанной с клеточной стенкой фракции белка совместных культур и каллусов, подвергнутых воздействию СК, предполагает их активную концентрацию в зоне растительной клеточной стенки, которая, как известно, является наиболее близким к внешней окружающей среде и к фитопатогену компонентом клетки. Этот факт является еще одним свидетельством вовлечения этой изоформы в процессы взаимодействия растительной клетки с фитопатогенами, поскольку в контрольных неинфицированных и не подвергнутых воздействию СК фракциях белка эта изоформа практически не проявляется. Высокая активность пероксидазы, проявляющаяся в среде культивирования каллусов, говорит об ее активной секреции из цитоплазмы в апопласт, где она, как было ранее показано, участвует в укреплении клеточных стенок [Otte, Barz, 2000] и может препятствовать активному росту фитопатогенов [Sharma, Singh, 2002]. Активная продукция Н2Ог клетками каллуса и обнаружение в зоне инфекции некротизированных клеток предполагает, что эти реакции являются проявлением устойчивости, вызываемой СК. Эти события, как известно, лежат в основе формирования СК - индуцированной устойчивости растений [Metraux, 2001]. Можно полагать, что наблюдаемые нами изменения в состоянии инфицированных каллусов, растущих на среде с СК, являются следствием развития защитных реакций под влиянием СК и, в частности, ведущих к лигнификации клеточной стенки [Thulke, Conrath, 1998]. Интересны данные об изменении активности изоферментов пероксидазы в процессе цитодифференцировки в культуре клеток и тканей люцерны [Hrubkova, Cvikrova, 1992], поскольку показано, что СК индуцирует в каллусах растений формирование эмбриогенных структур [Luo et al., 2000]. Так, например, показано, что при введении в культуру клеток чрезвычайно высока активность щелочных пероксидаз. Однако, в последующем, в морфогенных каллусах доля щелочных изоформ снижается, но усиливается синтез кислых. Эмбриогенный каллус преимущественно содержит кислые изоформы при следовых количествах щелочных [Hrubkova, Cvikrova, 1992]. По изоферментному составу пероксидазы регенеранты не отличаются от нормальных растений люцерны. Замечено, что добавление в среду культивирования каллусов люцерны фузариотоксинов не влияло на активность цитоплазматических пероксидазы, но приводило к многократному повышению уровня ионно-связанных с клеточной стенкой [Hrubkova, Cvikrova, 1992]. Особо следует отметить то, что добавление салициловой кислоты в среду культивирования каллусов Zingiber officinale индуцировала их нечувствительность к фузариотоксинам [Prachi et al., 2002]. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что каждый изофермент имеет свои специфические функции в растениях, связанные, вероятно, с определенными запрограммированными в геноме этапами деления, роста и дифференциации клеток, а также защитными генами, запускающимися при повреждениях и инфицировании. Мы обнаружили, что СК оказывала отрицательное действие на активность многих изопероксидаз. Однако часть изоформ этого фермента под воздействием СК может и избирательно повышать свою активность. Так, происходит увеличение активности анионной изопероксидазы с pi 3.5 и pi 9.7, сорбирующихся на компоненты клеточных стенок фитопатогенных грибов. В каллусах, подвергнутых воздействию салициловой кислотой, а в последствии инфицированных, наблюдается активация пероксидаз с pi 7.5, антифунгальное свойство которой описано в работе С. Caruso с соавторами [2001]. Полученные результаты позволяют предположить, что повышение активности пероксидаз, задействованных во взаимодействие с фитопатогенами, связано именно влиянием салициловой кислоты [Agrawal et al., 2002]. Одним из ключевых моментов проявления воздействия отмеченных препаратов является усиление под их влиянием выделения белков, в том числе и пероксидазы, во внеклеточную фазу культивируемых каллусов, где они могут способствовать агрегированию меристематических клеток растений [Xu et al., 1998]. К тому же пероксидазы обладают определенной антигрибной активностью [Минибаева, Гордон, 2003]. В ионно-связанной с клеточной стенкой фракции белка СК вызывала накопление анионной пероксидазы, тогда как ХОС изменяли активность только ее катионных изоформ. Если СК вызывала появление во внеклеточной фракции белка анионной пероксидазы, активность которой многократно повышалась при инфицировании, то ХОС такого эффекта не вызывали. В среде культивирования каллусов, содержащихся на ХОС, активность анионной пероксидазы практически не проявлялась. В то же время в отличие от СК препарат ХОС вызывал накопление в среде культивирования катионной пероксидазы с pi 9.7.
