Иммунохимическое исследование регуляторной субъединицы с АМР-зависимой протеинкиназы и типа Свешникова, Елена Васильевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. сАМР-зависимые протеинкипазн (ПК) являются регуляторними ферментами клетки, участвующими в развитии биологического ответа на воздействие внешних сигналов: гор-ионов, нейромедиаторов, Факторов роста и др. ПК осуществляют ре-гуляторнув функцию путем фосфорилирования различных белков, ко-

Молекула ііь. KtHj^-iuE""?*? """"и тті,^;, ^»~"чи «^ ш_Л~ каталитических (с) и двух регуляторних (r) суОоєдипиц. о »^-.:. комплексе R ингибирует активность с-субъедшшцы. При повшпении уровня camp в клетке происходит диссоциация фермента с образованием комплекса R с camp и свободной ферментативно активной с-субъединицы. Она осуществляет перенос r-фосфатз АТФ на серико-вые и треониновые остатки аминокислот белков-субстратов, m vitro многие белки могут' служить субстратами сАМР-эависимых проте-инкиназ. in vivo объект фосфорилирования определяется внутриклеточной локализацией R-суОъединицы, которая заякоривает фермент вблизи белка-субстрата. Таким образом, r определяет активность фермента и субстрат фосфорилирования.

Интерес к этим ферментам существенно возрос после того, как обнаружилась их связь с процессами пролиферации и дифференциров-ки клеток. В работах cho-chung et al. было показано участие регуляторних субъеданиц II типа (Ш) в торможении пролиферации злокачественных клеток человека. Вот почему остается актуальным изучешга структуры rII, локализации функциональных участков и их взаимодействия в ее молекуле, а также возможности специфического воздействия на ее функции.

В решении этих задач целесообразно использовать современные методы иммунохимии, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью. Ранее'иммунологические метода применяли для определения содержания ПК в тканях, изучения их тканевой и видовой спе-' ^v цифичности. Использование ае антител для изучения структуры rII и воздействия на ее основные функции носило отрывочный характер, и имеющиеся сведения по этому вопросу довольно противоречивы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении иммуяохимических свойств нейрональной RII, влияния антител на ее основные функции и сравнении rII из мозга человека и животных.

В соответствии с поставленной целью работа состояла из следующих этапов:

1. выделение RII из мозга свиньи, быка и человека;

2. получение антител на нейрональную Ш;

3. характеристика антител к RII;

4. локализация антигенных детерминант на молекула RII;

5. изучение влияния внтител на основные функции RII, а именно, на связывание camp и образование холофермента in vitro;

6. сравнение RII из мозга человека, быка и свиньи;

7. исследование влияния антител к RII на пролиферацию клеток в культуре.

Научная новизна и практическая ценность исследования. Впервые была выделана в гомогенном состоянии регуляторная субъ-единица сАМР-эависимой протеинкиназы II типа из мозге человека и описаны ее отличия от RII из мозга других млекопитающих. В частности, обнаружено, что в мозге человека присутствуют две изофор-мы RII, различающиеся по молекулярному весу, тогда как в мозге быка и свиньи она представлена только одной изофорыой. Большой набор внтител, использованный в настоящей работе, позволил выявить ишунохимические различия между RII мозга разных млекопитающих.

Впервые были получены антитела, стабилизирующие сАМР-зави-симую протеинкиназу II типа в активной форме.

Разработаны подхода для использования антител в качестве специфического агента для изучения роли сдмр-зависимого фосфори-лирования в регуляции пролиферации лейкемичаских клеток в культуре.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на vi Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотндов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" 3-7 октября 1988 г. (Петрозаводск), на международном симпозиуме, организованном институтом ИМ. Р.Коха, "International symposium on iiranunotherapeutic prospects of infectious diseases" 8-II МЭЯ 1990 г. (Берлин), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" 1990 г. (Минск) и на семинаре отдела биотехнологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и.лечения

(1994 Г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, оОзор литературы, описание методов, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 12? страницах машинописного текста, включая 7 таблиц и 25 рисунков.