Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что дыхательная цепь Escherichia coli содержит две терминальные оксидазы: хинолоксидазу feo-типа и хинолоксидазу id-типа, уровень экспрессии которых зависит от различных условий роста, таких как, например, фаза роста, условия аэрации и др. (Ingledew&Poole,1984;Gennis,1987). Преимущественная экспрессия одной из альтернативных терминальных оксвдаз E.coli в определенных условиях, по-видимому, может объясняться различиями в их биохимических свойствах и функциональной роли. В настоящее время причина существования, функциональная роль и физиологическое значение разветвленности дыхательной цепи на терминальном участке у данного микроорганизма остаются неизвестными.
С одной стороны, данные, полученные Теннисом и соавтор, при изучении характеристик роста мутантных штаммов E-coli, содержащих только одну из двух терминальных оксидаз, позволили авторам выдвинуть предположение о функциональной идентичности ферментов Ьо- и W-типа (Green&Gennis,1983;Au et al.,1985). Однако позднее, в лаборатории Викстрема было показано, что, хотя, как хинолохсидаза Ьо-, так и М-типа катализирует редокс-реахцию четырехэлектронного восстановления кислорода до НгО с образованием Лрн\ но при этом терминальная оксвдаза типа Ьо функционирует как протонная помпа, а оксидаза Ы-тлт образует Арн* только за счет скалярных процессов по обе стороны мембраны (Puustinen et al.,1991).
В то же время, в нашей лаборатории были получены данные, показывающие, что клетки E.coli содержат Na+ -транспортирующую терминальную оксидаэу при росте в условиях, сопровождающихся понижением уровня ДДн* на плазматической мембране данной бактерии (Avetisyan et al,1989,1991). Естественно встает вопрос: какая из двух альтернативных терминальных оксвдаз этого микроорганизма ответственна за использование иона натрия в качестве сопрягающего иона, и каким образом регулируется переключение работы терминального участка дыхательной цепи E.coli на натриевый режим?
В настоящее время известно, что уровень экспрессии оксвдаз Ьо- и Ы-типа регулируется arc -и fiir" -системами (luchi et al.,1990;Spiro&Guest,199l). Показано, что air-система принадлежит к семейству так называемых двукомпонентных регулгторных систем и состоит из рецепторного белка ЛгсЯ и белка регулятора АгсЛ (Iuchi&Lin,1988;Iuchi et al,1989). Природа сигнала, рецептируемого этой системой, на данный момент неизвестна. Первоначально предполагали, что индукция терминальных
'arc (от aerobic respiratory tontrol) "fhr (от fumarate nitrate reductase)
2 окендаз bo- и Ы-типа регулируется непосредственно содержанием кислорода в среде роста. Впоследствии было продемонстрировано, что кислород рецептируется на уровне дыхательной цепи и, исходя из этого, выдвигалось предположение, что увеличение уровня восстановленности одного из ей компонентов служит сигналом для arc-системьі (luchi et al,l990).
Следует также отметить, что при неблагоприятных условиях роста в клетках E.call наблюдается преимущественная экспрессия терминальной, окспдазы Ы-тнпа: [например, при лимитировании роста содержанием источника серы (Pooie&Haddock,1975)!' при смене акцептора электронов (Ing!edew&Poole,l984); при росте в присутствии цианида (Ashcroft&Haddock,1975); при различных мутационных повреждениях компонентов дыхательной непи (Сох е! a!,1970;Iuclii et аі,І990)]. Все зтн факторы могут приводить как к повышению уровня восстаноилснности компонентов дьіхательной цепи бактерии, так и к падению Л(1ц* на плазматической мембране. В связи с этим снижение уровня ЛДн* на сопрягающем мембране клеток тахже может рассматриваться в качестве сигнала для arc-системы, регулирующей экспрессию альтернативных терминальных окендаз E.cotl. і
Целью,.настоящей работы было, определить: 1) какая из двух терминальных
оксидач E.coli, хинолоксидаза Ы-типа или хинолоксидаза Ы-типа, способна использовать ион Nu* в качестве сопрягающего иона; 2) существует ли корреляция между уровнем экспрессии соответствующей терминальной окендазы E.coli в условиях роста, снижающих ЛДн* на плазматической мембране, и ее способностью переключаться на работу в "натриевом" режиме и, если существует, то 3) попытаться выяснить природу сигнала, регулирующего экспрессию терминальных окендаз в клетках E.coli и идентифицировать регуляторную систему, принимающую участие в этом процессе.
Научная новизна работы. В ходе исследований впервые обнаружено, что терминальная окевдаза Ы-типа, в отличие от окспдазы Ы-типа, вовлечена в процесс первичного транспорта Na+ в клетках E.coli, выращенных в условиях, снижающих ДРн* на сопрягающей мембране бактерий. В этих условиях определена положительная связь,между индукцией хиколокендаэы Ы-типа к появлением устойчивого к действию протокофора транспорта ионов натрия на терминальном участке дыхательной цепи клеток данного организма. На основе данных, полученных при изучении индукции хинолоксид'азы Ы-типа в клетках E.cali при различных- условиях роста, предложена гипотеза о роли ДДц* в качестве сигнала для переключения экспрессии терминальных оксидаз в клетках данного микроорганизма, а также показано участие arc-системы в, осуществлении такого типа рецепции.
Теоретическое и практическое значение рпПптм. Обнаружение способности
терминальной оксидазы bd-rvma в клетках E.coli демонстрировать феноменологию
первичной натриевой помпы расширяет круг ферментов, способных к транспорту Na+ за
счет энсрпт редокс-реакций у бактерий. Полученные результаты облегчают понимание
путей адаптации энергетического метаболизма и его регуляции в клетках прокариот,
способных к росту D условиях, понижающих Дрн* на сопрягающей мембране
микроорганизмов. Данные о участии arc-системы в процессе переключения синтеза
альтернативных терминальных оксндаз при росте клеток без протондвижущей силы могут
иметь значение для понимания природы репетируемого ситала этой регуляторной
системой. '
Апробанип работы. Результаты исследований были представлены на 7.-ой Европейской биоэнергетической конференции (Хельсинки, Финляндия,1992), на конференции ШРАВ, "Major electron transport complexes in photosynthesis and respiration" (Гмунден, Австрия,1993), на l и II Всероссийских конференциях "Белковая инженерия" (Москва, 1994,)993), на российско-германском симпозиуме молодых ученых (Оснабрюк, Германия,1994). Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетик» НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В Ломоносова (Москва, 1992,1993).
ftyfimmnnim. По материалам диссертации опубликовано б работ.
Объем и структури работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включающей разделы "Материалы и методы", "Результаты", и "Обсуждение"), выводов и списка цитируемой литературы.