Введение к работе
Актуальность темы. Согласно оценкам, в плазме крови человека может содержаться порядка 5 млн [Snyder, 2011] типов белков, основной вклад в которые вносят низкокопийные белки с концентрацией ниже 10"1Э М. Эти белки могут являться потенциальными маркерами различных патологических состояний человека, в том числе социально значимых заболеваний, таких, как ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009], онкологические заболевания [Dexlin-Melby et al., 2011; Rissin et al., 2010]. Некоторые из этих белков уже используются как онкомаркеры для диагностики. На ранних стадиях развития этих заболеваний белки-маркеры присутствуют в крови в концентрациях ниже
10" М. В [Rissin et al., 2010] приведены оценки, согласно которым для диагностики онкологических [Dexlin-Melby et al., 2011] и ранних стадий вирусных заболеваний (ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009]) концентрационный предел обнаружения (DL) диагностических методов также должен быть ниже 10" М. Стандартные диагностикумы, базирующиеся на методе иммуноферментного анализа (ИФА), не позволяют регистрировать белки
1 ^
при концентрации ниже 10" М [Archakov et al., 2009]. Очевидно, что такой чувствительности недостаточно для обнаружения низкокопийных белков-
маркеров, концентрация которых в крови ниже 10" М.
В последнее время были разработаны молекулярные детекторы, обладающие
высокой чувствительностью и позволяющие исследовать свойства единичных
молекул белков. Такая высокая чувствительность молекулярных детекторов
достигается за счет малого размера чувствительного элемента, сопоставимого с
размером белковых молекул. Среди этих детекторов можно выделить
электрические детекторы на основе нанопроволок (НП-детекторы) [Ivanov et al.,
2012; Vu et al., 2012; Tian et al., 2011; Stern et al., 2007; Zheng et al., 2005] и
наномеханические на основе атомно-силового микроскопа (АСМ-детекторы)
[Ivanov et al., 2013; Archakov et al., 2009; Huff et al., 2004]. В НП-детекторах в
качестве чувствительного элемента выступает нанопроволока из
полупроводникового материала, ширина которой составляет 10-100 нм. Белковые молекулы, адсорбирующиеся в процессе анализа на поверхность НП, через которую протекает электрический ток, модулируют проводимость нанопроволоки. Регистрация белковых молекул происходит путем измерения изменения токового сигнала от НП. НП-детекторы позволяют избирательно определять белки при их концентрациях 10" - 10" М в растворах и до 10" М в
сыворотке крови в реальном времени без использования меток. Тем не менее, проблемы, связанные с сильным влиянием неспецифического связывания нецелевых белков с поверхностью НП и нестабильность характеристик НП в настоящее время существенно ограничивают применение НП-детекторов.
АСМ-детекторы принципиально позволяют регистрировать и визуализировать единичные молекулы белков с субнанометровым разрешением в режиме их счета и проводить измерение размеров и различных физико-химических свойств этих молекул. Принцип действия АСМ-детектора основан на мониторинге сил взаимодействия зонда АСМ с поверхностью подложки и иммобилизованными на ней молекулами. Возможность регистрации единичных молекул белков с помощью АСМ достигается за счет того, что зонд АСМ имеет размер порядка 1-10 нм, что сопоставимо с размером белковой молекулы. Поэтому метод АСМ обладает несомненным преимуществом в качестве молекулярного детектора белков.
В протеомных аналитических системах в большинстве случаев используется технология фишинга, при использовании которой молекулы аналита переходят из большого объема анализируемого образца на небольшую поверхность аналитического чипа за счет связывания с этой поверхностью. При этом, как правило, используется обратимое связывание, когда иммобилизованные на поверхности чипа молекулы-зонды обратимо связывают молекулы аналита [Archakov et al., 2009]. При этом чувствительность определения белков при обратимом характере связывания ограничивается значением константы диссоциации комплексов аналита с молекулами-зондами на поверхности чипа (KJ) [Archakov et al., 2009]. В случае использования метода химического АСМ-фишинга молекулы аналита вылавливаются из раствора не на молекулы-зонды, а непосредственно на поверхность химически активированной зоны, которая занимает небольшую часть поверхности АСМ-чипа, и необратимо (ковалентно) связываются с этой поверхностью. При этом дополнительная стадия сенсибилизации поверхности чипа путем иммобилизации на ней молекул-зондов не требуется. В отличие от биоспецифического связывания, в случае химического фишинга максимальное количество центров связывания аналита ограничивается лишь количеством химических групп на поверхности чипа, доступных для химической активации. Ковалентный характер связывания молекул аналита в активированной зоне АСМ-чипа позволяет снять ограничение предела обнаружения определения белков, обусловленное влиянием диссоциации комплексов аналита с молекулами-зондами.
Комбинация метода ACM с методом фишинга позволяет сочетать преимущества двух методов. Разработка комбинированного метода регистрации
белка с пределом обнаружения ниже 10"1Z М является актуальным направлением исследований, направленных на создание аналитических систем для протеомики и медицинской диагностики.
Целью настоящей работы является создание высокочувствительного метода регистрации низкокопийных белков на базе АСМ-детектора.
Для достижения поставленной цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Разработка схемы метода химического АСМ-фишинга и подбор экспериментальных условий его реализации.
-
Экспериментальная реализация метода химического фишинга и
Q 17
обнаружение белков в растворах с концентрациями от 10" М до 10" М.
-
Создание теоретической модели для описания процесса химического фишинга белков при сверхнизких концентрациях.
-
Теоретический анализ параметров фишинга, определяющих концентрационный предел обнаружения белков с помощью предложенного подхода.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод химического АСМ-фишинга позволяет регистрировать белки при
сверхнизких концентрациях с пределом обнаружения 10" М без использования биоспецифических зондов и меток.
-
Метод химического АСМ-фишинга позволяет проводить регистрацию белков при сверхнизких концентрациях за время не более 3 часов.
-
Разработанная трехмерная модель, учитывающая пространственное движение жидкости в условиях принудительного перемешивания, позволяет описать процесс химического фишинга белков при сверхнизких концентрациях.
Научная новизна. Разработан метод химического АСМ-фишинга белков. Для реализации этого метода разработаны АСМ-чипы, на атомарно ровной поверхности которых формируется химически активированная зона малой площади. Неровность поверхности чипа после химической активации составляет ~1 нм, поэтому выловленные белки успешно регистрируются методом АСМ на такой поверхности в режиме их счета. Показано, что химический АСМ-фишинг
может быть использован для регистрации белков в растворе при сверхнизких концентрациях. Предложена теоретическая трехмерная модель, описывающая процесс АСМ-фишинга низкокопийных белков на АСМ-чип. С помощью этой модели показано, что белок может быть зарегистрирован методом химического АСМ-фишинга в растворе при концентрации 10" М без предварительного концентрирования образца и без использования дополнительных меток.
Научно-практическая значимость работы. Предложенная теоретическая модель позволяет определить значения основных параметров, влияющих на чувствительность метода химического АСМ-фишинга. Результаты теоретического моделирования позволят в дальнейшем определять параметры фишинга на стадии планирования эксперимента. Разработанный метод химического АСМ-фишинга может являться основой для создания сверхвысокочувствительных аналитических систем для протеомики.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Национальной конференции «Рентгеновское, синхотронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, 2011), Одиннадцатом ежегодном международном конгрессе Организации «Протеом человека» (США, Бостон, 2012), 55-й Научной конференции МФТИ (Москва, 2012), Пятом Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз Россия 2012» (Тверь, 2012), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013), весеннем финале конкурса «УМНИК» РАН (Москва, 2013).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из которых 2 статьи в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных и теоретических исследований и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 18 схем и рисунков. Библиографический список включает 182 источника, из них 20 источник отечественной литературы.
