Введение к работе
-3- Актуальность проблемы. В растениях су-іествует особый класс веществ - фитогормонов, осуществляющих ре-уляцию метаболических процессов на дальних расстояниях. В насто-щее время физиологические функции ауксинов, цитокининов, гиббе-еллинов, абсцизовой кислоты, этилена и брассинолидов не вызывают омнений. Современная концепция гормонов растений тесно связана с акими актуальными проблемами сельского хозяйства и биотехнологии, ак формирование и хранение урожая, размножение растений, культу-а клеток и тканей, формирование новых генетических измененных ипов растений и т.д. ( Lang,. 1956; Kutachek, et.al., 1981 ).
Однако до сих пор некоторые моменты биохимии, а также меха-измы действия эндогенных регуляторов на начальных этапах росто-ых процессов у проростков остаются во многом неясными. Это отно-лтся, в частности, к их синтезу, транспорту, проявлению функци-дальиой активности, компетентности клетки к восприятию гормо-ільного сигнала, функционированию гормонов как единой регулятор-эй системы растения. Решение этих вопросов во многом зависит от пользования адекватных методов определения содержания эндоген-IX фитогомонов в растении, поиск которых продолжается в настоя-зе время.
Новые возможности для решения разнообразных проблем гормо-ільной регуляции открываются с внедрением иммунохимических мето-)в определения фитогормонов в сочетании с адекватной подготовкой істительного материала.
Иммунохимические методы давно используются в биохимии жи-1тных. Однако они долгие годы оставались за пределами интересов юхимиков фитогормонов, поскольку растительные гормоны по своей ироде яляются гаптенами, т.е. неполноценными иммуногенами, и не особны к выработке антител в крови животных. Тем не менее, в чале 1980-х годов было описано получение иммунной сыворотки к ксинам, а затем цитокининам, гиббереллинам и абсцизовой кислоте eiler,1983). В настоящее время продолжается процесс совершенст-вания иммунных методов тестирования фитогормонов. При этом проходит основательная перестройка всей системы анализа, но суть о остается прежней: получение конъюгата фитогоромона с белком и другим носителем для придания ему свойств антитела, получение мунной антисыворотки ( АС ) на этот конъюгат и использование ее я определения содержания гормона различными способами.
Наряду с эндогенными регуляторами роста в настоящее время известно огромное количество синтетических соединений, влияющих на биохимию и ростовые процессы растений. Хорошо изучено герби-цидное действие таких веществ, как глифосат ( N-фосфонометилгли-цин ) и триаллат ( Н,Н-диизопропил-3-(2,3,3-трихлораллил)тиокар-бамат ). Однако в литературе описаны, как побочные, эффекты их применения, проявляющиеся при обработке растений физиологическими дозами этих гербицидов и связанные с регуляторами роста - ауксинами и, в некоторой степени, АБК и цитокининами. Такое негерби-цидное действие возможно, имеет более важное значение, как для понимания глубинных механизмов действия гербицидов, так и в плане исследований гормональной системы растения.
Цель работы заключалась в разработке конкурентного варианта иммуноферментного метода анализа содержания эндогенных фитогормонов с применением его для характеристики начальных этапов роста проростков кукурузы, пшеницы и овса, а также в выяснении особенностей действия гербицидов глифосата и триаллата на уровень гормонов у этих растений.
В задачи исследования входило:
-
Разработка системы экстракционной очистки свободной индо-лилуксусной кислоты ( ИУК ) из растительных экстрактов с целью использования для определения этого гормона иммуноферментным методом .
-
Разработка иммун^-ферментных тест-систем для определения содержания ИУК также исследование специфичности полученной на ауксины антисыворотки к различным соединениям индольной природы.
-
Получение иммунных сывороток для определения природных и синтетических цитокининов. Выяснение возможных пределов применения иммуноферментной тест-системы на зеатинрибозид для определения содержания эндогенных цитокининов, а также их синтетического аналога - 6-бензиламинопурина ( БАП ).
-
Определение содержания ауксинов и цитокининов в проростках кукурузы с помощью разработанного нами варианта иммуноферментного анализа.
-
Выяснение особенностей действия гербицидов глифосата и триаллата, как возможных ингибиторов синтеза и транспорта фитогормонов в проростках кукурузы и злаковых культур.
Научная новизна. Разработан вариант конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа ауксинов, который
юзвояяет в динамике определять содержание эндогенных фитогормо-[ов в тканях растений на начальных этапах роста проростков. При-іеденньїе в работе данные показывают, что простой экстракционной чистки вполне достаточно для подготовки материала к иммунофер-іентному анализу ауксинов. Она позволяет освободиться от основной ассы интерферирующих иммуиореактивных компонентов. Это значи-ельно ускоряет процедуру определений и увеличивает точность и адежность метода. Установлено, что иммуноферментная тест-система бладают высокой специфичностью к природным эндогенным ауксинам, ричем иммунореактивность метилированной индолилуксусной кислоты казалась значительно выше кросс-реактивности антител по отноше-ию к другим испытуемым веществам индольной природы.
Полученная на эеатинрибозид антисыворотка позволяет с высоси точностью и чувствительностью определять природные цитокинины еатинового типа в неочищенном экстракте. С помощью антисыворотки 6-бензиламинопурин-рибозиду ( БАП-рибозиду ) впервые удалось ровести раздельное определение цитокининов синтетического проис-эждения группы БАП и природных соединений. Использование конъю-атов различных цитокининов позволяет изменять специфичность им-ігноферментной системы, приспосабливая ее к экспериментальным за-ічам.
С помощью иммуноферментного метода определения содержания ідогенних фитогормонов в тканях растений подтверждена справедли-зсть классического представления о гормональной регуляции путем іменения как количества, так и соотношения различных фитогормо->в. Показано, что под действием глифосата в проростках кукурузы >оисходит уменьшение общего содержания ауксинов, которое корре-грует с ингибированием роста растений. Аналогичные результаты і лучены при обработке проростков пшеницы триаллатом. Обнаружено, о снижение содержания эндогенных ауксинов зависит от концентра-[И гербицида в растворе, которым обработаны растения. Отмечена гложительная корреляция между содержанием эндогенных ауксинов и оростью роста растений пшеницы.
Практическая значимость. Разработанные ми экстракционная очистка растительного материала и иммунофер-нтные тест-системы позволяют с высокой точностью и чувствитель-стью определять природные фитогормоны. Высокая надежность и орость анализов необходимы для решения разнообразных проблем рмональной регуляции. С помощью АС к БАП-рибозиду можно прово-
дить определение цитокикинов синтетического происхождения группы БАП и кинетина в культуре тканей, где они широко используются, а также в различных модельных системах при изучении механизма действия этих гормонов. Определение содержания эндогенных фитогормо-нов с помощью иммуноферментного анализа, а также выяснение механизма действия гербицидов на рост культурных растений могут быть полезны для ускорения внедрения результатов теоретических разработок в практику селекции и сельского хозяйства.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" ( УФА, 1987 ), на 7-й Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" ( Юрмала, 1987 ), на Ш-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки ( Петрозаводск, 1988 ), на 2-ом съезде Всесоюзного общества физиологов растений ( Минск, 1990 ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объетов и методов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах, содержит 23 рисунка, 8 таблиц. Список использованной литературы включает 195 наименований, из них 78 на русском языке.