Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная физико-химическая энзимология имеет на наш взгляд следующие характерные особенности: а) с одной стороны происходит накопление фундаментальных знаний о механизме действия ферментов и ферментных систем, существующих в природных объектах; и б) с другой стороны прилагаются активные усилия, направленные на поиск возможностей использования ферментов как биокатализаторов в области технологии.
Во втором случае чрезвычайно важными, очевидно, являются два аспекта. Один из них связан с развитием и оптимизацией технологических процессов, для которых уже известна возможность применения ферментов (т.е. речь идет о традиционных областях применения ферментов и ферментных препаратов). Основной задачей исследователя здесь является отыскание максимально эффективных способов применения ферментов или ферментных систем в более или менее изученных биотехнологических процессах. Одним из ярких примеров ферментов такого рода является группа целлюлолитических ферментов под общим названием 'целлюлазы', входящая в состав целлюлазного комплекса. В общем случае результатом действия целлюлазного комплекса является деструкция целлюлозы и её производных до глюкозы (в ряде случаев - и до дн- и олигосахаридов). Целлюлазы традиционно используются для осахаривания возобновляемого целлюлозосодержащего растительного сырья и отходов его переработки. Этот процесс является альтернативой кислотному гидролизу растительного сырья и позволяет получить такие важные продукты как глюкозу и продукты ее последующей биологической трансформации (этанол, карбоновые и аминокислоты, антибиотики, витамины, полисахариды, белки и другие). Необходимо отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные требует значительно более мягких условий проведения процесса и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.
Второй аспект связан с поиском возможностей применения уже существующих ферментов по новому назначению, или же с поиском для этой цели новых ферментов (т.е. для исследователя речь здесь идет о поиске нетрадиционных областей применения ферментов и ферментных препаратов).
В последнее время, при исследовании свойств ферментов, входящих в состав целлюлазного комплекса, обнаружились следующие новые интересные возможности использования как комплекса в целом, так и его отдельных компонентов: это отбеливание целлюлозной массы в ходе её вторичной переработки (удаление следов чернил, тонеров и иных загрязнений с поверхности макулатуры), ферментативная депигментация текстильных (хлопчатобумажных) изделий с целью придания им более
привлекательных потребительских свойств, биополировка поверхности текстильных изделий, использование цсллюлаз в моюших средствах и многое другое.
Создание подобных новых ферментативных процессов невозможно без поиска целлюлолитических ферментов с новыми свойствами или с высокой удельной активностью, выделения в гомогенном состоянии и исследования их свойств, поиска новых штаммов-продуцентов этих ферментов или получения мутантных штаммов при помощи методов классической генетики или генетической инженерии.
Одним из таких комплексов целлюлолитических ферментов является, на наш взгляд, комплекс ферментов, продуцируемых штаммом Pcnicilliwn verruculosum.
Цель и задачи исследования. Целью этой работы являлось
исследование биохимических и каталитических свойств
целлюлолитических ферментов, входящих в состав целлюлазного комплекса, продуцируемого грибом P. verruculosum, и определение причин его высокой активностью по отношению к кристаллической целлюлозе. Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:
Исследовать возможность применения целлюлазного комплекса /'. verruculosum для осахарнвання целлюлозосодержащих материалов.
Провести анализ качественного и количественного состава целлюлазных комплексов, полученных при различных условиях ферментации P. verruculosum, и выбрать ферментные препараты для последующего фракционирования и очистки.
Разработать (оптимизировать) способ выделения и очистки индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса P. verruculosum.
Изучить биохимические и каталитические свойства выделенных компонентов.
Выбрать среди выделенных компонентов целлюлазного комплекса Р. verruculosum ключевой (ключевые) с точки зрения активности по отношению к кристаллической целлюлозе.
Разработать метод селективного определения активности целлобиогидролазы в присутствии других компонентов целлюлазного комплекса.
Научная новизна. Установлено, что целлюлазный комплекс Р. verruculosum обладает высокой способностью к осахариванию целлюлозосодержащих материалов, а также высокой активностью с точки зрения депигментации хлопчатобумажных текстильных изделий. Существенно усовершенствована традиционная схема выделения и очистки индивидуальных ферментов с использованием ионообменной хроамтографии, предложена схема выделения входящих в состав
препаратов целлюлазного комплекса P. verruculasum белков в одну стадию при помощи иммуноаффинной хроматографии, получен ряд гомогенных ферментов. Показано, что целлобиогидролаза обладает высокой активностью по отношению к микрокристаллической целлюлозе, проявляет высокую степень синергизма с эндоглюканазой при гидролизе кристаллической и аморфной целлюлозы, а также - в отличие от многих известных целлобиогидролаз - имеет низкую адсорбционную способность (низкое сродство к целлюлозе). Выделена и охарактеризована целлобназа P. verrnculosum, показано, что помимо высокой гидролитической активности она проявляет трансгликозилнрующую активность.
Практическая значимость работы. Предложен ряд новых перспективных препаратов целлюлазных комплексов, секретируемых продуцентом P. vemiculosum, пригодных для эффективного ферментативного осахаривания целлюлозосодержащих материалов. Разработан высокочувствительный и экспрессный микрометод определения концентрации восстанавливающих Сахаров, требующий крайне незначительного расхода ферментов и пригодный для быстрого измерения активности в большом количестве образцов ферментов. Предложен метод селективного определения активности целлобиогидролзы в присутствии других компонентов целлюлазного комплекса.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международных конференциях "Биокатализ" (Суздаль, 1995), конференции молодых ученых "Ломоносов-96" (Москва, 1996) и 213-м совещании Американского Химического Общества (Сан-Франциско, 1997).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ссылок. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц.