Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1.Чувствительность нейральных стволовых клеток к действию ионизирующего излучения и цитотоксических препаратов 12
1.1.1 Чувствительность нейральных стволовых клеток к действию ионизирующего излучения 13
1.1.2 Механизмы повреждения ЦНС при облучении мозга, несвязанные с нарушением нейрогенеза в гиппокампе 15
1.1.3 Образование и репарация повреждений ДНК в облученных клетках 18
1.1.4 Роль активных метаболитов кислорода и азота в повреждении нейральных стволовых клеток при действии ионизирующего излучения.
1.1.5. Повреждение нейральных стволовых клеток при действии химиотерапевтических препаратов 27
1.1.6. Разработка полимерных форм противоопухолевых препаратов для пролонгирования их действия и снижения неспецифической токсичности. 28
1.2 Поиск перспективных нейропротекторов для снижения уровня повреждений нейральных стволовых клеток после токсических воздействий 31
1.2.1.Исследование возможности использования антиоксидантов в защите НСК при действии излучения 32
1.2.2 Использование трансплантации НСК для стимуляции регенерации клеток головного мозга после токсических воздействий 36
1.2.3. Потенциал мезенхимальных стволовых клеток для стимуляции процессов восстановления тканей и регенерации НСК после радиационных поражений 37
2. Материалы и методы 51
2.1.Выделение НСК и МСК из костного и головного мозга и жировой ткани мышей 51
2.1.1 Выделение НСК 51
2.1.2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из головного мозга мышей (МСК-ГМ) 51
2.1.3. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мышей (МСК-КМ)
2.1.4. Выделение МСК из жировой ткани 52
2.2.Культивирование клеток 53
2.2.1.Культивирование НСК 53
2.2.2. Культивирование МСК-ГМ 54
2.2.3. Культивирование МСК-КМ 55
2.2.4. Культивирование МСК -ЖТ 55
2.2.5. Культивирование клеток линии феохромоцитомы крысы PC12
2.3. Иммуноцитохимический анализ специфических антигенов НСК мыши 56
2.4. Фенотипирование НСК с помощью проточной цитометрии 57
2.5. Облучение клеток 59
2.6. Подсчет НСК в камере Горяева 59
2.7. Анализ клоногенной активности. 59
2.10. Индукция дифференцировки НСК мыши [179] 61
2.11. Окрашивание НСК антителами к фосфорилированному гистону Н2АХ c помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии 61
2.12. Исследование защитного действия антиоксидантов на НСК 63
2.13. Получение и характеистика ПФЭ на основе биосовместимого биодеградируемого сополимера ПЛГА . 63
2.14. Исследование противоопухолевой активности ПФЭ в сравнении с этопозидом in vivo 64
2.15. Приготовление среды, кондиционированной МСК, и ее характеристика
2.15.1. Получение кондиционированной среды МСК-КМ, МСК-ГМ, МСК-ЖТ, для анализа влияния на дифференцировку клеток линии РС12 65
2.15.2. Получение кондиционированной среды МСК-ЖТ для исследования ее влияния на НСК и защитного действия кондиционированной среды после облучения и действия этопозида и ПФЭ. 65
2.15.3. Определение уровня цитокинов в кондиционированной среде МСК-ЖТ 65
2.15.4. Определение активности нейротрофинов среде, кондиционированной МСК, по ее влиянию на индукцию дифференцировки клеток линии РС12 [183] 66
2.16. Исследование защитного действия кондиционированной среды -МСК после облучения НСК 66
2.17. Микроскопия 67
2.18. Статистическая обработка. 67
3. Результаты исследований 68
3.1. Исследование чувствительности НСК мыши к действию -излучения. 68
3.1.1. Характеристика НСК мыши. 68
3.1.5. Анализ содержания фокусов гистона Н2АХ в НСК после облучения 71
3.1.2.Изучение зависимости выживаемости НСК мыши от дозы -излучения. 74
3.1.3. Исследование влияния облучения на способность НСК к дифференцировке 79
3.1.4. Исследование радиозащитного действия антиоксидантов на развитие радиационных повреждений НСК in vitro 83
3.2. Исследование противоопухолевой активности полимерной формы этопозида в сравнении с действием свободного этопозида 88
3.2.1. Изучение специфической активности полимерной формы противоопухолевого препарата этопозида in vitro 88
3.2.1. Изучение специфической активности полимерной формы противоопухолевого препарата этопозида in vivo 91
3.2.2. Изучение токсичности свободной и полимерной формы этопозида в отношении НСК. 93
3.3. Изучение нейропротекторной активности факторов, секретируемых МСК 95
3.3.1. Получение кондиционированной среды МСК 95
3.3.2. Исследование активности нейротрофинов, в среде, кондиционированной МСК из разных тканей мыши, с использованием клеток феохромоцитомы крысы линии РС12. 95
3.3.2.Определение уровня цитокинов в КС МСК-ЖТ 97
3.3.3. Изучение влияния КС МСК из жировой ткани мыши на выживаемость НСК. 98
3.3.4. Изучение нейропротекторной активности факторов, секретируемых МСК из жировой ткани мыши, на НСК при действии -излучения. 99
3.3.5. Изучение нейропротекторной активности факторов, секретируемых МСК из жировой ткани мыши, на НСК при действии этопозида 104
4. Заключение 106
5. Выводы 113
Список литературы
- Повреждение нейральных стволовых клеток при действии химиотерапевтических препаратов
- Выделение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мышей (МСК-КМ)
- Получение и характеистика ПФЭ на основе биосовместимого биодеградируемого сополимера ПЛГА
- Исследование противоопухолевой активности полимерной формы этопозида в сравнении с действием свободного этопозида
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее перспективных и востребованных видов
лечения широкого спектра онкологических заболеваний наряду с химиотерапией является
лучевая терапия. Однако даже при оптимизированных методах лечения, обеспечивающих
значительное увеличение продолжительности жизни больных, более чем в 50% случаев
развиваются радиационные осложнения, вызванные повреждением нормальных тканей
(Johannesen et al, 2003). Частым осложнением при лучевой и химиотерапии опухолей
мозга является развитие в отдаленный период прогрессирующих нарушений таких
когнитивных функций, как память и внимание, и развитие деменции у 20-50% больных,
продолжительность жизни которых значительно возрастает благодаря успешной
элиминации опухоли. Молекулярные и клеточные механизмы развития нарушений
функций мозга при действии ионизирующего излучения и химиотерапии и подходы к
профилактике и лечению таких нарушений изучены очень мало, хотя их разработка
крайне актуальна. Полагают, что высокая чувствительность когнитивных функций к
облучению мозга и химиотерапии у взрослых в значительной мере определяется
нарушением нейрогенеза в субгранулярной зоне зубчатой извилины в гиппокампе в
результате повреждения нейральных стволовых клеток (НСК) (Raber et al., 2004). При
этом существенный вклад в повреждение НСК вносят активные метаболиты кислорода,
образующиеся при действии ионизирующего излучения (Tseng et al, 2013, 2014). Поэтому
одним из направлений поиска нейропротекторов, которые позволили бы снизить уровень
повреждения НСК при облучении, является изучение соединений, обладающих
антиоксидантной активностью (Oh SB, et al, 2013.). Защитным действием в отношении
НСК могут обладать также нейротрофины (Nguyen N., et al. 2009) и факторы,
секретируемые мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) (Munoz J. et al., 2005;
Miller RH et al., 2010). В настоящее время для снижения неспецифической токсичности
противоопухолевых препаратов и пролонгирования их действия разрабатываются
технологии получения полимерных форм таких лекарств путем включения препаратов в
полимерные частицы субмикронных размеров. Перспективным препаратом для
использования в полимерной форме является этопозид. Его действие, как и действие
-излучения, сопровождается образованием двунитевых разрывов (ДР) ДНК. Токсичность
таких препаратов в отношении НСК не изучена.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение чувствительности
НСК мыши к действию -излучения, изучение противоопухолевой активности этопозида
в свободной и полимерной форме (ПФЭ) и его токсичности в отношении НСК, и поиск
способов защиты НСК от действия радиационных и химических генотоксических факторов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Получение и характеристика НСК из головного мозга мыши;
-
Изучение повреждения и репарации ДНК НСК при действии - излучения;
-
Изучение радиочувствительности НСК при действии - излучения в диапазоне малых и терапевтических доз в динамике после воздействия;
-
Изучение защитного действия комплекса антиоксидантов в отношении облученных НСК;
-
Изучение противоопухолевой активности полимерной формы этопозида в сравнении со свободным этопозидом;
-
Изучение токсичности ПФЭ в сравнении со свободным этопозидом в отношении НСК;
-
Получение и характеристика культуральной среды, кондиционированной МСК мыши (КС) из разных тканей;
-
Изучение защитной активности КС МСК в отношении НСК при действии -излучения и этопозида в свободной и полимерной форме.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые охарактеризована радиочувствительность НСК
мыши, культивируемых in vitro в виде нейросфер и в виде прикрепляющихся клеток при действии -излучения. Впервые показано, что в НСК происходит эффективная репарация ДР ДНК, оцениваемых по образованию гистона Н2АХ. Впервые обнаружена стимуляция дифференцировки НСК в нейроны при действии дозы 0,1 Гр и снижение способности НСК дифференцироваться в нейроны и астроциты после облучения в дозе 4 Гр. Впервые показана высокая противоопухолевая активность полимерной формы этопозида в экспериментах in vitro и in vivo. Обнаружено, что МСК секретируют факторы, активность которых позволяет защищать НСК от цитотоксического действия -излучения и этопозида.
Практическая значимость работы
Важное практическое значение имеют новые данные о возможности защиты НСК от действия -излучения и действия этопозида с помощью комплекса факторов, секретируемых МСК, используемых в виде среды, кондиционированной МСК.
Практическая значимость работы заключается в том, что показана высокая
противоопухолевая активность новой формы этопозида в виде полимерной формы
лекарства, что обеспечивает его меньшую токсичность и пролонгацию действия без увеличения токсичности в отношении НСК. Полученные результаты являются основой для проведения доклинических и клинических исследований этой новой формы этопозида.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены: на ХIII и ХIV Курчатовской молодежной научной школе, НИЦ «Курчатовский институт», 2015 и 2016 г.; на Международной конференции Ломоносов - 2016.
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 31 августа 2016 года на заседании кафедры биохимии лечебного факультета ПМГМУ им. И.М. Сеченова и на заседании Научно-технического совета Курчатовского комплекса НБИКС-технологий от 19 сентября 2017 г.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков, 12 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов исследования», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 186 источников.
Публикации
Повреждение нейральных стволовых клеток при действии химиотерапевтических препаратов
Активные метаболиты кислорода (АМК) постоянно образуются в процессе жизнедеятельности клеток при нормально протекающем обмене веществ. Супероксидный анион-радикал кислорода (СОАК) O2– в водной среде вступает в реакцию дисмутции с образованием кислорода и пероксида водорода: 2НО -- О2 + Н2О2. Пероксид водорода в реакции, катализируемой ионами переходных металлов, подвергается восстановлению с образованием гидроксильного аниона и свободого гидроксильного радикала: Н2О2 + Мевосст- НО" + НО + Меокисл. При взаимодействии СОАК с Н2О2 образуется синглетный кислород 102 и свободный гидроксильный радикал. Процесс образования СОАК и его метаболитов может быть индуцирован также химическими веществами и действием излучения [64].
Внутриклеточная локализация СОАК зависит от пути его образования: он возникает в митохондриях при функционировании ряда дегидрогеназ, моноаминооксидазы, дигидрооротатдегидрогеназы; в пероксисомах при действии гликолатоксидазы и ацил-КоА-оксидазы; в цитозоле при действии пиридоксамин-5-фосфатоксидазы, в микросомах при действии НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и в митохондриях неферментативным путем при взаимодействии кислорода с коэнзимом Q, а также в процессе биосинтеза простагландинов из арахидоновой кислоты при действии простагландинсинтетазы [65]. АМК, образющиеся в клетках при нормальном метаболизме и при действии излучения, могут вызывать модификацию оснований ДНК и накопление разрывов.
Исследованию образования и роли АМК в повреждении НСК при действии излучения посвящен ряд исследований. Для количественного определения СОАК в митохондриях используется флуоресцентный краситель MitoSOX Red, а суммарное количество АФК и азота (анион пероксинитрита) ONOO– можно измерять с помощью препарата carboxy H2DCFDA [5(6)-карбокси-2 ,7 -дихлородигидрофлуоресцеиндиацетат]. Отметим, что как MitoSOX Red, так и carboxy-H2DCFDA, превращаются во флуоресцирующие производные после окисления АФК, образующимися в клетке. Однако эти красители взаимодействуют с разными видами радикалов и имеют разную локализацию действия в клетке. MitoSOX Red проникает в митохондрии, окисляется СОАК, образующимися в митохондриях, и не взаимодействует с другими активными формами кислорода или азота. Сarboxy-H2DCFDA, в отличие от MitoSOX Red, не проникает в митохондрии и, соответственно, не взаимодействует с АФК, образующимися непосредственно в митохондриях. Сarboxy-H2DCFDA - бесцветное не флуоресцирующее неполярное соединение, которое сначала гидролизуется внутриклеточными эстеразами с образованием не флуоресцирующего полярного производного (H2DCF), а затем H2DCF быстро окисляется в присутствии внутриклеточных АФК или активных метаболитов азота с образованием 2 ,7 -дихлорфлуоресцеина - соединения с интенсивной зеленой флуоресценцией. Таким образом, при использовании Сarboxy-H2DCFDA определяется основная часть АФК и анион пероксинитрита (активная форма азота; для определения оксида азота используется краситель DAF-FM), находящиеся в цитоплазме [66, 67]. После действия гамма-излучения на культуру НСК крысы повышение АФК, регистрируемое с использованием красителя Сarboxy-H2DCFDA, на 10 и 20% было обнаружено уже через 6 часов после облучения клеток в дозе 1 и 5 Гр соответственно. При этом повышенный уровень АФК в выживших клетках сохранялся в течение 3-4 недель после облучения in vitro [68]. В специальном исследовании тем же коллективом авторов было показано, что НСК высоко чувствительны к действию окислительного стресса, и что радиочувствительность НСК, подвергавшихся действию такого стресса, возрастает [69, 70]. При действии малых доз (10-50 сГр) повышение уровня АМК через 6-48 часов после действия гамма-излучения не обнаружено, но через 36 часов отмечено возрастание уровня оксида азота. При действии ускоренных протонов (250 МэВ, плато, 50 сГр) на НСК мыши через 6 и 12 часов после облучения отмечено повышение АМК и оксида азота. НСК человека были более чувствительны: при облучении этих клеток в дозах 10-100 сГр повышение уровня АМК и оксида азота обнаружено и при действии гамма-излучения и при действии протонов, но уровень СОАК возрастал только при дозе 100 сГр [5, 71].
Повышение уровня АМК и оксида азота было обнаружено уже при действии малых доз излучения, поэтому в связи с космическими полетами крайне актуальным оказался вопрос и о действии малых доз космического излучения с высокой линейной передачей энергии на НСК. С использованием культуры НСК мыши было показано, что НСК, количество которых определяли по числу нейросфер, устойчивее, чем нейральные клетки-предшественники, количество которых определяли путем подсчета общего числа клеток, к действию ускоренных ионов 56Fe (1-8 Гр, 600 МэВ/нуклон). Увеличение АМК через 12 и 24 часа при облучении ионами 56Fe было пропорционально дозе облучения в диапазоне таких малых доз, как 2-15 сГр, и наблюдалось в течение длительного времени, по-крайней мере в течение 8 недель. Такой окислительный стресс оказывал модулирующее действие на чувствительность клеток к последующему облучению, повышая их устойчивость к действию последующего гамма-излучения и облучению нейтронами в низких дозах.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мышей (МСК-КМ)
НСК выделяли из головного мозга новорожденных мышат в стерильных условиях. Извлеченный из черепной коробки мозг переносили в чашку Петри с 2 мл дезагрегирующего раствора, содержащего 10 ед/мл папаина ("Sigma-Aldrich"), который активировали при 37оС за 30 мин до применения, 0,5 мМ глутамакса ("Life Technologies") и 0,16 мг/мл ДНКазы ("CalBiochem") в среде DMEM/F12 ("Life Technology"), тщательно измельчали скальпелем и помещали в СО2-инкубатор на 15-30 минут. После этого ткань ресуспендировали, добавляли трипсин до концентрации 0,125% и опять помещали в СО2-инкубатор на 15-20 мин. После этого клетки собирали с помощью центрифугирования (700 об/мин, 5 мин), осадок клеток два раза промывали средой DMEM/F12, ресуспендировали в ростовой среде и подсчитывали количество живых клеток в камере Горяева с использованием трипанового синего.
МСК-ГМ выделяли из головного мозга мышей в возрасте 1-2 месяца, как описано в работе [177]. Животных умерщвляли путем цервикальной дислокации. Головной мозг извлекали, промывали культуральной средой, измельчали скальпелем в чашке Петри и ресуспендировали в среде DМЕМ/F12. Клетки собирали центрифугированием (400 g, 10 мин), осадок дважды промывали средой, ресуспендировали в среде DМЕМ/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 50 мкг/мл гентамицина (Life Technologies, США) и переносили суспензию клеток в культуральные матрасы
У мышей линии C57Black получали клеточный аспират из костномозгового канала большеберцовых костей путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали 5 мин. при 1500 об/мин. Супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в культуральной среде MEM (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) и 50 мкг/мл гентамицина (Life Technologies, США) и переносили в культуральные флаконы 25 см2 в количестве 40 тысяч клеток/см2 на 24 часа для прикрепления к пластиковой поверхности. Через 24 часа неприкрепившиеся клети удаляли, прикрепившиеся клетки, которые составляли популяцию МСК-КМ, промывали 2 раза фосфатно-солевым буфером и культивировали до достижения субконфлуентного состояния при 37 0С при 5% СО2 в увлажненной атмосфере
Мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани (МСК-ЖТ) получали из подкожного жира 30-дневных мышей. Фрагменты жировой ткани измельчали ножницами, затем гомогенизировали в среде DMEM/ F12 без сыворотки. К суспензии фрагментов жировой ткани в среде добавляли раствор коллагеназы (конечная концентрация 0,08%) и инкубировали суспензию при перемешивании 1 ч при 37оС. Собирали клетки с помощью центрифугирования (1200 об/мин, 10мин.) и отдельно собирали оставшиеся фрагменты жировой ткани. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM F12 с 10% ФБС для нейтрализации коллагеназы, собирали клетки с помощью центрифугирования (1200 об/мин, 10мин.), ресуспендировали в 10 мл среды DMEM с 10% ФБС и 1% раствора антибиотиков/антимикотиков и переносили в культуральный флакон объемом 75 см2 для прикрепления к пластиковой поверхности. После прикрепления (через 24 часа) клетки тщательно промывали ФСБ, вносили культуральную среду и культивировали до достижения субконфлуентного состояния при 37оС, 5%СО2 в увлажненной атмосфере. Оставшиеся фрагменты жировой ткани повторно обрабатывали коллагеназой и повторяли эту процедуру еще 2 раза, каждый раз перенося клетки из осадка в культуральной среде в новый культуральный флакон.
НСК высевали в 6-луночные культуральные планшеты или в чашки Петри в плотности 1-2 х 104 клеток/см2 и культивировали в увлажненной атмосфере в СО2-инкубаторе при содержании СО2 5% при 37 оС. После формирования нейросфер размером 150-200 мкм в диаметре (через 5-7 дней) их собирали центрифугированием (500 об/мин, 5 мин), осадок ресуспендировали в растворе аккутазы (Gibco, США), инкубировали 5 мин при 37 оС, повторно ресуспендировали с использованием тонкого наконечника на 200 мкл, помещали в СО2-инкубатор на 5 мин и повторяли ресуспендирование с использованием тонкого наконечника. Далее клетки промывали средой DMEM/F12 и собирали с помощью центрифугирования (2000 об/мин, 5 мин). Осадок ресуспендировали в полной культуральной среде DMEM/F12 (Invitrogen), содержащей NaHCO3 2,4 мг/мл, глюкозу 0,6%; Hepes 0,5 мМ, прогестерон 60 нг/мл, путресцин 9,6 мкг/мл, инсулин 4,2 мкг/мл, трансферрин 3,8 мкг/мл, селенит натрия 1 мкг/мл, гепарин 1,8 мкг/мл, (все компоненты "Sigma-Aldrich"), EGF ("PeproTech") 20 нг/мл, bFGF ("PeproTech") 10 нг/мл, В27 ("Life Technologies") 2% и переносили в низкоадгезивный планшет (Corning-Costar) или чашки Петри, покрытые матригелем для культивирования НСК в прикрепленном виде, диаметром 100 мм в плотности 10-20 клеток/мкл для дальнейшего культивирования в СО2-инкубаторе при 370С в увлажненной атмосфере с 5% СО2.
Получение и характеистика ПФЭ на основе биосовместимого биодеградируемого сополимера ПЛГА
Таким образом, сочетание антиоксидантной активности темпола и комплекса В27 обладает более высокой защитной активностью при облучении НСК, чем каждый из этих препаратов в отдельности.
Заключая исследование влияния облучения на НСК необходимо отметить, что в результате проведенных исследований обнаружена высокая радиочувствительность НСК мыши при оценке их выживаемости по количеству клеток. Радиочувствительность НСК мыши, оцениваемая по их клоногенной активности – по количеству нейросфер, была более низкой, чем при оценке по выживаемости клеток. НСК, выжившие после облучения в дозах 1 и 2 Гр, сохраняли способность к дифференцировке в нейроны и астроциты. Способность НСК, выживших после облучения в дозе 4 Гр, к дифференцировке в нейроны и астроциты снижена, причем особенно сильно снижена дифференцировка НСК в нейроны. Показано, что при действии невысоких доз гамма-излучения, таких как 1 и 2 Гр, нейропротекторной активностью обладает антиоксидантный препарат темпол.
Характеристика полученного препарата ПФЭ приведена в таблице 6. Для исследования цитотоксической активности ПФЭ в отношении различных клеток in vitro в сравнении со свободным этопозидом (субстанция этопозид) использовали семь линий опухолевых клеток и линию нормальных клеток человека и две линии клеток мыши. Эксперименты на клетках мыши линии Р388 были поставлены, в связи с тем, что далее Таблица 6. Характеристика препарата полимерной формы этопозида. Состав препарата ПФЭ Размер частиц, нм Компоненты Содержание,% Этопозид 8 440,7 ± 4,2 PLGA 50/50 60 ПВС 15 D-маннитол 17 планировалось проведение экспериментов in vivo с использованием этих клеток. Эффективность ПФЭ исследовали как в отношении исходной чувствительной линии клеток миелолейкоза человека К562, так и ее сублиний К562ADR, характеризующейся резистентностью к адриамицину благодаря высокому уровню белка MDR1 – одного из белков, определяющих множественную лекарственную устойчивость клеток. По кривым выживаемости опухолевых клеток в зависимости от концентрации препаратов рассчитывали значение IC50 – концентрацию препаратов, при которой выживаемость клеток составляет 50% от контроля. Полученные значения IC50 для ПФЭ и субстанции этопозида приведены в табл.7. Как следует из представленных данных, ПФЭ обладает высокой цитотоксической активностью в отношении широкого спектра опухолевых клеток разных типов, включая клетки линии К562ADR, характеризующиеся множественной лекарственной устойчивостью. Так, значения IC50 свободного этопозида для линий К562 и К562ADR составили 22,0 ± 0,5 и 74,3 ± 8,7мкМ, в то время как ПФЭ - 32,1± 5,8 и 32,2 ± 5,4 мкМ соответственно. ЦТА ПФЭ, оцениваемая по показателю IC50, была, в зависимости от типа клеток, либо Таблица 7. Характеристика цитотоксической активности полимерной формы этопозида в сравнении со свободным этопозидом в отношении опухолевых и нормальных клеток человека и лимфолейкоза мыши.
Легочные эмбриональные фибробласты, линия LECH-4 20,7 ± 6,4 18,0 ± 2,8 - отличия между субстанцией этопозида и ПФЭ достоверны, р 0,05; А - отличия от неопухолевых клеток человека достоверны, р 0,05. близка к ЦТА свободного этопозида, либо превышала ЦТА субстанции этопозида, о чем свидетельствуют более низкие значения ICso- ЦТА ПФЭ в отношении нормальных клеток человека линии LECH-4 - легочных эмбриональных фибробластов - не отличалась от ЦТА свободного этопозида. Важно отметить, что ЦТА свободной формы этопозида в отношении нормальных клеток была либо более высокой, чем в отношении опухолевых клеток (линии MCF-7, SW837, К562ADR), либо такой же, как в отношении опухолевых клеток (линии Сасо-2, Colo 320HSR, К562). Не смотря на то, что ЦТА ПФЭ в отношении опухолевых клеток линии SW837 была достоверно выше, чем ЦТА свободного этопозида, эти клетки оставались более устойчивыми к ПФЭ, чем нормальные. В отличие от свободного этопозида клетки линий Сасо-2 и Colo 320HSR были достоверно более чувствительны к ПФЭ, чем нормальные. Значение IC50 свободного этопозида и ПФЭ для лимфолейкоза мыши составило 0,3мкМ, для линий нейробластомы мыши IC50 составил 8,6± 1,0 мкМ, в то время как ПФЭ - 12,5±2,4 мкМ. Таким образом, цитотоксичность ПФЭ в отношении нейробластомы мыши ниже, чем свободного этопозида. Клетки лимфолейкоза мыши были значительно более чувствительны к этопозиду и ПФЭ, чем опухолевые клетки человека.
Динамика роста солидной опухоли лимфолейкоза мыши линии Р388 после лечения препаратами этопозида в полимерной форме и в виде свободного препарата. Приведены средние значения размера опухоли и стандартное отклонение. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг по этопозиду на 1, 5 и 9 сутки после прививки опухоли, суммарная доза 75 мг/кг. 1- контроль - животным вводили физиологический раствор, 2 – ПФЭ, 3 – свободный этопозид. - отличия от контроля по критерию Стьюдента достоверны (р 0,05); # - отличия между группами 2 и 3 по критерию Стьюдента достоверны (р 0,05).
Представленные данные позволяют заключить, что при внутрибрюшинном введении мышам как ПФЭ, так и свободного этопозида в указанных дозах достигается существенное ингибирование роста опухолей. При использовании ПФЭ эффект ингибирования был более длительным. Так через неделю после окончания введения препаратов средний размер опухоли в группе животных, получавших ПФЭ, был достоверно ниже, чем в группе животных, получавших свободный этопозид (рисунок 18, кривые 2 и 3 соответственно). ТРО в этот период составляло 88,2% для ПФЭ и 75,0% для свободного этопозида. Полученные данные свидетельствуют о пролонгировании противоопухолевого действия при использовании ПФЭ, что в свою очередь обеспечило и УПЖ животных, получавших ПФЭ, до 31,8% по сравнению с 23,1% для животных, получавших свободный этопозид.
Таким образом, как показано в экспериментах in vitro и in vivo, ПФЭ обладает высокой противоопухолевой активностью и после проведения более широких доклинических исследований препарат ПФЭ может быть рекомендован для проведения клинических испытаний. Поэтому важно оценить его возможную токсичность в отношении НСК в сравнении с действием свободного этопозида.
Исследование противоопухолевой активности полимерной формы этопозида в сравнении с действием свободного этопозида
Этопозид - противоопухолевый препарат, относящийся, как показано в обзоре литературы, к полусинтетическим эпиподофиллотоксинам, производным 4 -диметилэпиподофиллотоксина, который содержится в экстракте мандрагоры. Фармакологически активным является его транс изомер. Механизм действия этопозида связан со способностью ингибировать активность ДНК-топоизомеразы II – фермента, участвующего в формировании репликативной вилки для обеспечения репликации ДНК. Роль топоизомеразы II заключается в создании и воссоединении разрывов в обеих цепочках молекулы ДНК для ослабления ее суперспирализации. Этопозид стабилизирует комплекс ДНК с топоизомеразой II и препятствует воссоединению разрывов, что приводит к накоплению ДР в ДНК, и, вследствие этого, к ингибированию биосинтеза ДНК и пролиферации опухолевых клеток и к их гибели. Таким образом, этот препарат относится к препаратам, обладающим генотоксическим действием. Считается, что цитотоксическое действие в отношении нормальных клеток наблюдается только при использовании этопозида в высоких дозах, однако в отношении НСК его действие изучено не было. Поэтому одной их важных задач явилось исследование противоопухолевой активности ПФЭ – препарата, полученного в лаборатории клеточной биологии и молекулярной медицины, - в сравнении со свободным этопозидом, в экспериментах in vitro и in vivo, и исследование их действия на НСК.
Нами показано (таблица 6), что ПФЭ обладает высокой цитотоксической активностью в отношении широкого спектра опухолевых клеток разных типов, включая клетки линии К562ADR, характеризующиеся множественной лекарственной устойчивостью. ЦТА ПФЭ, оцениваемая по показателю IC50, была, в зависимости от типа клеток, либо близка к ЦТА свободного этопозида, либо превышала ЦТА субстанции этопозида, о чем свидетельствуют более низкие значения IC50. ЦТА ПФЭ в отношении нормальных клеток человека линии LECH-4 – легочных эмбриональных фибробластов – не отличалась от ЦТА свободного этопозида.
В экспериментах на животных при внутрибрюшинном введении мышам как ПФЭ, так и свободного этопозида в указанных дозах достигается существенное ингибирование роста опухолей. При использовании ПФЭ эффект ингибирования был более длительным. Так через неделю после окончания введения препаратов средний размер опухоли в группе животных, получавших ПФЭ, был достоверно ниже, чем в группе животных, получавших свободный этопозид (рисунок 17, кривые 2 и 3 соответственно). ТРО в этот период составляло 88,2% для ПФЭ и 75,0% для свободного этопозида. Полученные данные свидетельствуют о пролонгировании противоопухолевого действия при использовании ПФЭ, что в свою очередь обеспечило и увеличение СПЖ (p 0,05): по сравнению с контрольной группой УПЖ животных, получавших ПФЭ и свободный этопозид, составило 31,8% и 23,1% соответственно.
Таким образом, мы показали, что ПФЭ обладает высокой противоопухолевой активностью и после проведения более широких доклинических исследований препарата ПФЭ он, с нашей точки зрения, может быть рекомендован для проведения клинических испытаний. При исследовании ЦТА ПФЭ и свободного этопозида в отношении НСК показано, что оба эти препарата высоко токсичны. Чувствительность НСК к этим препаратам была значительно более высокой, чем чувствительность опухолевых клеток и фибробластов человека и клеток лимфолейкоза мыши. Многие препараты, в том числе этопозид, не проникают через гематоэнцефалический барьер и тем не менее, поиск средств защиты НСК при действии облучения и цитотоксических препаратов, обладающих генотоксическим действием, крайне актуален для предотвращения нарушения когнитивных функций у больных, получающих лучевую терапию и химиотерапию с использованием таких препаратов. В обзоре литературы мы обосновали перспективность исследования кондиционированной среды МСК в качестве нейропротекторных препаратов.
Мы показали, что кондиционированная среда, полученная при культивировании МСК разных типов, обладает активностью нейротрофинов. При этом наиболее высокая активность была обнаружена при использовании МСК, выделенных из жировой ткани мыши. Это позволило выбрать МСК-ЖТ в качестве источника нейротрофинов для защиты НСК. Кроме того, мы показали, что среда, кондиционированная этими клетками, содержит такие регуляторные цитокины, как IL6, HGF,TGF и VEGF. Эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF) оказывает нейротрофическое и протективное действие, ростовой фактор гепатоцитов (HGF) оказывает защитное действие путем стимуляции антиапоптотического белка blc-2. Цитокин TGF- обладает трофическим действием. Цитокин IL -6 обладает широким спектром биологической активности и оказывает репаративное действие при повреждении ЦНС и индуцирует экспрессию VEGF. Таким образом, в составе среды, кондиционированной МСК-ЖТ, присутствуют факторы защиты от повреждающего действия разных факторов [184]. Комплекс этих цитокинов в сочетании с нейротрофинами может оказывать регуляторное и защитное действие на НСК.
В наших экспериментах было обнаружено, что КС МСК оказывала защитное действие и после облучения НСК и после действия. Эффективность защитного действия зависела от дозы облучения и была наиболее высокой при дозах до 2 Гр включительно. При действии этопозида защитный эффект также был выражен, и наблюдался при относительно высоких дозах препарата. Полученные результаты по изучению нейропротекторного действия комплекса факторов, секретируемых МСК, являются основой для дальнейших исследований в этой области.