Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1. Химическая структура каротиноидов 10
2. Локализация каротиноидов . 19
3. Защитное действие каротиноидов 19
За. Взаимодействие с синглетным кислородом 20
36. Взаимодействие с триплетным хлорофиллом 22
4. Окислительно-восстановительные превращения каротиноидов 23
5. Оксидазная и пероксидазная активность каротиноидов 31
6. Перенос энергии синглетного возбуждения на хлорофилл 32
7. Тршшет-триплетный перенос энергии от хлорофилла к каротиноидам 34
8. Участие каротиноидов в реакциях переноса электрона 39
8а. Гипотетические представления о механизме участия каротиноидов в процессе фотосинтеза 43
ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава II. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
1. Методы исследования 48
2. Объекты исследования 54
Глава III. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ФУКОКСАНТИНА 56
I. Препаративное получение фукоксантина 56
la. Экстракция пигментов 56
16. Перевод пигментов в диэтиловый эфир 58
1в. Хроматография пигментов 60
1г. Освобождение от бесцветных примесей 61
2. Спектральные свойства фукоксантина 63
2а. Спектры поглощения в видимой области 63
26. Определение молярного коэффициента экстинкции 64
2в. Спектры поглощения в ультрафиолетовой области 70
3. Обсуждение результатов 73
Глава ІV. ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФУКОКСАНТИНА В РАСТВОРАХ 75
1. Исследование при комнатной температуре 75
2. Исследование при низкой температуре 77
3. Исследование фотоиндуцированных изменений оптической плотности фукоксантина непосредственно
в процессе освещения при комнатной температуре . 81
4. Обсуждение результатов 85
Глава V. ИССЛЕДОВАНИЕ ШТО ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФУКОКСАНТИНА. В ТВЕРДОЕ СЛОЯХ 88
I. Фотовольтаический эффект 88
1а. Растворы чистых электролитов 91
16. Влияние доноров и акцепторов электрона 91
1в. Влияние рН среды 95
1г. Влияние кислорода воздуха 95
Ід. Обсуждение результатов 95
2. Фотопроводимость 99
2а. Слои чистого фукоксантина 102
26. Бинарная система с акцептором электрона 106
2в. Обсуждение результатов 108
Глава УІ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФУКОКСАНТИНА С ХЛОРОФИЛЛОМ ИЗ
1. Триплет-триплетный перенос энергии 113
1а. Исследование методом флеш-фотолиза 113
16. Исследование методом импульсной фотопроводимости 114
2. Тушение синглетного кислорода 117
3. Тушение флуоресценции хлорофилла а и феофитина а фукоксантином 123
4. Фотоэлектрические свойства смешанных слоев фукоксантин + хлорофилл а 131
4а. Спектры действия фотопроводимости 131
46. Миграция энергии 139
5. Межмолекулярное взаимодействие фукоксантина и хлорофилла а 146
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 149
ВЫВОда 152
ЛИТЕРАТУРА .' 155
- Химическая структура каротиноидов
- Методы исследования
- Препаративное получение фукоксантина
- Исследование при комнатной температуре
- Фотовольтаический эффект
Введение к работе
Фотосинтез является единственным процессом на Земле, создающим органическое вещество. Проблема изучения этого важнейшего процесса принадлежит к ряду основных проблем биологии. В фотосинтезе главную роль выполняют пигменты, которые осуществляют поглощение солнечной энергии и превращение её в энергию химических связей в первичных фотохимических реакциях.
Из всего существующего в природе многообразия фотосинтетических пигментов наиболее полно и систематически изучены фотохимические свойства пигментов хлорофиллового типа /11,25,26-40, 55-73,183/. Согласно современным представлениям, эти пигменты осуществляют первичное превращение световой энергии в химическую. Каротиноиды являются постоянными спутниками хлорофилла во всех видах фотосинтезирующих организмов и также как порфирино-вые пигменты сосредоточены в тилакоидных мембранах хлоропластов и хроматофоров. Согласно литературным данным, каротиноиды in vivo могут выполнять несколько функций необходимых для нормальной жизнедеятельности фотосинтезирующих организмов. К настоящему времени развиты представления о роли каротиноидов в качестве вспомогательных пигментов, снабжающих дополнительной энергией электронного возбуждения хлорофилловые пигменты /176,197, 338/, о защитной роли против необратимого фотоокисления хлорофилла и других клеточных структур синглетным кислородом /158, 201/, обсуждается непосредственное участие каротиноидов в процессе фотосинтетического выделения кислорода /101,174,320/, предполагается возможность взаимодействия между хлорофиллом и каротинондами на уровне переноса электрона /69,72,128,263-266/. Специфические особенности химической структуры каротиноидных молекул позволили ряду исследователей разработать гипотетические представления о возможности прямого участия каротиноидов в первичных фотохимических реакциях при фотосинтезе /256-267,290, 291,296/. Реальность таких представлений в последние годы подтверждается экспериментальными данными /120,279,298,308,310/. Существуют предположения о том, что каротиноиды могут играть активную фотохимическую роль в таких фотобиологических явлениях как Фототропизм, фотопериодизм, фототаксис и др./21,247,342/. Однако, истинная роль и механизм участия каротиноидов в процессе Фотосинтеза пока еще окончательно не выяснены. Решение этих вопросов невозможно без тщательного изучения свойств различных представителей класса каротиноидов.
Настоящая работа посвящена изучению фотобиохимических свойств фукоксантина, принадлежащего к группе кислородсодержащих каротиноидов - ксантофиллов. Этот пигмент обнаружен у трех видов широко распространенных морских водорослей: бурых Сйіео-phyceae ), диатомовых (Bacilariaphyceae) и золотистых (Cnriso-phyceae ), принадлежащих к классу Pheophyta. Зукоксантин in vivo тесно связан с хлорофиллом и составляет основную массу желтых пигментов указанных видов водорослей /200/. Изучение фукоксантина представляет большой теоретический и практический интерес в связи с широким распространением в природе бурых и диатомовых водорослей, которые в процессе фотосинтеза образуют почти половину всего органического вещества, синтезируемого на земном шаре.
В кристаллическом виде фукоксантин впервые был выделен Вилыптеттером и Пейджем в 1914 году из бурых водорослей. Молекулярная формула фукоксантина ^42' молекулярный вес -658,9, точка плавления 168-169С /134/. Структурная формула этого пигмента (рис.1) определена Боннеттом /134,135/. Согласно последней номенклатуре каротиноидов /219/, фукоксантин относится к группе спиртовых эфиров. Основная полоса поглощения изолированного пигмента лежит в синей области спектра (400-500 нм). В нативном состоянии взаимодействие фукоксантина с окружающими его молекулами пигмент-липопротеидного комплекса приводит к смещению поглощения этого пигмента в желто-зеленую область спектра (500-600 нм), благодаря чему диапазон использования падающей световой энергии указанными видами фотосинтезирующих организмов значительно расширяется. Высокое содержание фукоксан-тина в бурых и диатомовых водорослях и его тесная связь с хлорофиллом, по-видимому, обусловливается участием этого пигмента в процессе фотосинтеза. Определенным подтверждением этому предположению служат экспериментальные данные, показавшие высокую эффективность участия поглощенного фукоксантином света в выделении кислорода in vivo /175,207,283,334,345,346/ и флуоресценции хлорофилла in vivo /176,345/ и in vitro /202,321/. Других экспериментальных данных, касающихся изучения свойств фукоксан-тина в свете современных представлений о возможных функциях каротиноидов в процессе фотосинтеза в литературе не тлеется.
Целью настоящей работы является исследование в модельных системах спектральных, фотохимических и фотофизических свойств фукоксантина и его взаимодействия с хлорофилловыми пигментами в связи с изучением роли данного пигмента в процессе фотосинтеза водорослей.
сн3 сн3 ососе-
Рис.1. Структурная форцула сТукоксантша
Химическая структура каротиноидов
Большое влияние на изучение химического строения растительных пигментов оказал метод хроматограшического адсорбционного анализа, разработанный в 1903 году М.С.Цветом. К настоящему времени химическая структура большинства представителей кароти-ноидных пигментов, входящих в состав фотосинтезирующих организмов, хорошо изучена и освещена в многочисленных литературных обзорах /21,199,200,216,219/.
Каротиноиды принадлежат к классу углеводородов и их окси-генированных производных. Химическая структура каротиноидов характеризуется длинной прямой ненасыщенной углеродной цепью, состоящей из восьми изопреновых единиц, соединенных таким образом, что две ближайшие к центру молекулы метильные группы находятся в положении 1:6, тогда как все другие боковые метильные группы - в положении 1:5. В скелете основных каротиноидов содержится 40 или близкое к этому числу количество углеродных атомов. Центральная часть молекулы состоит из 18 углеродных атомов и содержит 7 коньюгированных двойных связей и 4 метильных группы (рис.2). Цепь коньюгированных чередующихся двойных связей составляет хромофорную систему и часто заканчивается на одном или обоих концах кольцом ионона. Каротиноидные пигменты, благодаря наличию в их молекулах большого количества гидрофобных группировок, хорошо растворяются в различных органических растворителях и нерастворимы в воде.
Каротиноиды делятся на бескислородные - каротины и кислородсодержащие - ксантофиллы.
Каротины. Наиболее известными представителями этой группы каротиноидов являются d-, J2-, -каротины и ликопин. Они очень хорошо растворимы в углеводородах и все имеют эмпирическую формулу С40Н56.
Самым распространенным каротином в растительном мире является В-каротин. Его молекула содержит II двойных коньюгированных связей, две из которых входят в иононовые кольца в положении 5:6 и 5 :6 (рис.3).
6-Каротин (рис.4) - изомер -каротина. В молекуле этого пигмента двойная связь в одном иононовом кольце смещена в положение 4:5 (сб-иононовое кольцо; кольцо с двойной связью в положении 5:6 называется -иононом) и поэтому неконыогирована с остальными двойными связями.
В молекуле у-каротина имеется лишь одно #-иононовое кольцо, вместо второго кольца - группировка псевдоионона (рис.5). Этот каротин содержится, главным образом, в зеленых серных бактериях.
Методы исследования
Освещение образцов в опытах по изучению фотохимических свойств фукоксантина в растворах проводили конденсированным светом от лампы накаливания 500 Вт, прошедшим через слой Ъ% раствора CuSO .
Для измерения фотоиндуцированных изменений оптической плотности растворов пигмента непосредственно в процессе освещения использовали двухволновой спектрофотометр фирмы "Хитачи" модель 356. Возбуждение фукоксантина осуществляли монохроматическим светом с длиной волны 470 нм от лампы ІШ-25 при использовании фильтров ЖС-І7 и ЖС-І8. Регистрацию оптической плотности проводили в полосе 430 гол, перед ФЭУ помещали фильтры ФС-7 и СЗС-22.
Для измерения оптической плотности растворов использовали кварцевую вакуумную кювету толщиной I см.
В опытах, проводиглых при низкой температуре (-45С), охлаждение реакционной смеси в процессе освещения осуществляли путем погружения измерительной кюветы в прозрачный сосуд Дьюа-ра, заполненный этиловым спиртом с сухим льдом. В процессе спектрофотометрических измерений образец помещали в специально сконструированный металлический кюветодержатель заполненный проточным спиртом охлажденным до температуры опыта.
Измерение фотопотенциалов. Фотопотенциалы пленок фукоксантина, нанесенных на платиновый электрод и опущенных в раствор электролита (2 М КОН или 2 Мксі), измеряли потенциометром ЛПУ-ОІ. Осветительная система была такой же, как при фотохимических исследованиях. Пленки пигмента получали путем нанесения на платиновый электрод капли концентрированного раствора фуко-ксантина в смеси диэтилового и петролейного Ст.кип.40-70С) эфиров (1:1) с последующим испарением в атмосфере теплого воздуха. Полученные таким способом пленки продолжительное время сохраняли активность и не смывались при промывании их струей воды.
Очистку платиновых электродов проводили прокаливанием в пламени газовой горелки, а в случае сильного загрязнения платины - электролитическим способом /115/. Перед нанесением пленки пигмента проверяли чистоту электрода, освещая его в растворе электролита на воздухе и в вакууме.
Опыты проводили в вакуумном сосуде с агаровым затвором (рис.14). Стандартным электродом сравнения служил хлорсеребря-ный электрод с насыщенным раствором ксі.
Препаративное получение фукоксантина
Из многочисленных методов экстракции пигментов из растительного материала /119,198-200,302,325-327,334,364/ для наших целей наиболее подходящей оказалась экстракция 65%-ным водным метанолом /334/ и 80%-ным водным ацетоном /198/.
65$-ный водный метанол избирательно извлекает фукоксантин и хлорофилл с (Хл с) с небольшой примесью хлорофилла а (Хл а), что значительно облегчает дальнейшую работу по получению фукоксантина (Фк) в чистом виде. Измельченные водоросли помещали в большую воронку с фильтром Шота и проісладкой из фильтровальной бумаги, заливали растворителем и по прошествии 30-40 минут экстракт отсасывали водоструйным насосом в колбу Бюхнера. После многократного повторения экстракции водоросли теряли бурую окраску и приобретали зеленый цвет вследствие извлечения основной массы Фк. На рисунке 16 (кривая I) приведен спектр поглощения пигментов, извлеченных из цистозиры 65%-ным метанолом, после перевода их в диэтиловнй эфир. Кривая поглощения подтверждает, что данный растворитель извлекает главным образом фукоксантин (максимум 448 нм) и небольшие количества Хл с (максимумы 580 и 630 нм) и Хл а (максимумы 444 и 662 нм). Для сравнения на этом же рисунке приводится спектр поглощения пигментов, извлеченных последующей экстракцией данного образца водоросли 80%-ным водным ацетоном. Преобладающим в этом случае является поглощение Хл а.
В процессе работы нами было обнаружено, что водный ацетон также избирательно экстрагирует основную массу Фк и Хл с с относительно небольшой примесью Хл а, если операции производить с замороженными водорослями при температуре растворителя не выше 4С. На рис.17 представлены спектры поглощения пигментных экстрактов, полученных в результате первоначальной экстракции (кривая I) и экстракции, проведенной после извлечения основной массы Фк (кривая 2). Преимуществом этого способа является значительно большая скорость экстракции по сравнению с 65%-ным метанолом и меньший объем требующегося растворителя.
Для препаративного получения Фк в данной работе использовали главным образом второй способ экстракции. Дальнейшей обработке подвергались только экстракты обогащенные Фк.
Исследование при комнатной температуре
Освещение подкисленных растворов Фк (-1-10 М) в присутствии воздуха или содержащих п-бензохинон (10""-10 М) сопровождалось необратимым выцветанием пигмента, которое за 30 мин освещения составляло приблизительно 12% и 30% соответственно. Подщелачивание приводило к значительному замедлению реакции, а в случае п-бензохинона - к необратимоглу возрастанию оптической плотности (Д) раствора пигмента (2-3% за 30 мин освещения) (рис.22). Аналогичное повышение оптической плотности происходило при освещении обезгаженных нейтральных и щелочных растворов Фк без добавок или содержащих по отдельности гидрохинон и аскорбиновую кислоту (10 -10 М).
В тройной системе обнаружено фотосенсибилизирующее действие Фк в реакции восстановления метилового красного аскорбиновой кислотой (1-Ю М). Поскольку спектры поглощения метилового красного и Фк сильно перекрываются, то при наблюдении за ходом фотосенсибилизированной реакции учитывалась возможность прямого фотовосстановления метилового красного. На рис.23а показано, что в присутствии пигмента метиловый красный восстанавливается гораздо скорее, чем в его отсутствие, что свидетельствует о наличии явной способности Фк к фотосенсибилизации. Соответствующие изменения спектра поглощения приведены на рис.236. Скорость фотосенсибилизированной реаіщии возрастает при увеличении концентрации Фк (от 10 до ТОМ) и зависит от рН среды. Максимальная интенсивность реакции наблюдалась при рН 6,7. Скорость реакции уменьшается при смещении рН в обе стороны от этой точки.
Ранее /50/ была показана способность Л-каротина, адсорбированного на различных носителях, фотосенсибилизировать восстановление тионина и метилового красного аскорбиновой кислотой.
Фотовольтаический эффект
Согласно современным представлениям, возникновение фотопотенциала (Ш) на инертном металлическом электроде, несущем твердую пленку пигмента и погруженном в раствор электролита, в основном отражает наличие и характер фотохимических окислительно-восстановительных реакций, протекающих с непосредственным участием молекул пигмента /37,38,40,86-88,91,92/.
Исследование фотовольтаического эффекта в пленках фотосинтетических пигментов впервые было проведено Евстигнеевым и Терениным в 1951 году. На основании работ лаборатории Теренина /91,92/ был установлен "дырочный" механизм фотопроводимости в пленках хлорофилла и его аналогов. Было составлено представление о механизме генерации ФЇЇ в слоях этих пигментов /38,107/. Суть этого механизма состоит в том, что возникновение Ш на металлическом электроде, несущем пленку пигмента и погруженном в раствор электролита, содержащем окислитель, является результатом передвижения свободной электронной вакансии - "дырки", образовавшейся в результате захвата окислителем возбужденного светом оптического электрона пигмента, по направлению к электроду в результате последовательного заполнения генерированной светом положительной "дырки" электроном основного уровня соседней молекулы. Достигнув электрода, такая вакансия заполняется электроном металла, что влечет за собой образование положительного фотопотенциала. Наиболее значительную роль в генерации положительного Ш играют, вероятно, процессы связанные с фотохимическим переносом электрона между возбужденными молекулами пигмента и электронноакцепторными молекулами, адсорбированными на поверхности или внедрившимися в объем слоя /106/.
Если в электролите присутствует восстановитель, то электронные вакансии в слое пигмента, образовавшиеся в результате перехода возбужденного светом электрона на более высокий энергетический уровень, могут заполняться электронами восстановителя. В этом случае к поверхности электрода в толще пигмента будут передвигаться электроны, а не полозштельно заряженные "дырки", что приведет или к уменьшению положительного, или возникновению отрицательного заряда на поверхности электрода.
