Введение к работе
Актуальность проблемы. Микросомная монооксигеназная система, локализованная в эндоплазматических мембранах различных органов и тканей, метаболизирует различные химические компоненты биологического и антропогенного происхождения (лекарств, ядов, химических факторов загрязнения окружающей среды, пищевых добавок, гормонов и т.д.), содержащихся в воде, воздухе, почве, пищевых продуктах. Способность этой системы окислять огромное число ксенобиотиков (КС) и эндогенных субстратов обусловлена функционированием множественных форм ее ключевого фермента - цитохрома Р450 (CYP) (Nelson & Strobe!, 1987). Ксенобиотики претерпевают в организме метаболическую активацию, превращаясь в промежуточные электрофильные продукты. Эти метаболиты либо удаляются из организма, либо взаимодействзтот с макромолекулами клетки (ДНК, РНК, белки), что приводит, в конечном счете, к развитию процессов канцерогенеза.
Функционирование множественных форм CYP определяет различные эффекты ксенобиотиков, в связи с чем становится очевидной необходимость изучения механизмов, регулирующих их активность.
Цитохромы Р450 подсемейства 2В участвуют в метаболизме лекарственных препаратов, а также осуществляют детоксикацию многих ксенобиотиков с самой разнообразной химической структурой (Nelson & Strobel, 1987; Nebert et al., 1991). Эти ферменты индуцируются большой группой структурно неродственных индукторов (органические растворители, пестициды, хлорированные бифенилы и лекарства). Основным индуктором этой группы является фенобарбитал (ФБ), к этой группе также относится трифе-нилдиоксан (ТФД) (Мишин и др., 1990). Механизм активации генов CYP2B в печени крыс при индукции фенобарбиталом до конца неясен и широко дискутируется в специальной литературе (Waxman & Azaroff, 1992; Waxman, 1994). Не определена до конца роль позитивного и негативного регуляторных элементов промотора генов CYP2B в инициации транскрипции. Не показано, как осуществляется их взаимодействие с ядерными белками во время транскрипции генов CYP2B. Кроме того, не известно, является ли действие индукторов ФБ-типа универсальным, как это описано для полициклических ароматических углеводородов, или каждый индуктор запускает особенный механизм активации генов CYP2B.
Целью настоящей работы являлось изучение механизмов активации генов CYP2B1/2B2 в печени крыс при индукции трифениддиоксаном и фенобарбиталом.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить активность цитохромов Р4502В1 в метаболизме специфичного субстрата пентоксирезоруфина в печени крыс, индуцированных фенобарбиталом или трифениддиоксаном.
-
Определить динамику накопления мРНК генов CYP2B при индукции фенобарбиталом и трифениддиоксаном.
-
С помощью гель-ретардацио иного анализа исследовать взаимодействие позитивного и негативного элементов проксимального участка про-моторной области генов CYP2BM2 с ядерными белками, изолированными из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом или трифениддиоксаном в интервале от 6 до 72 часов после их введения.
-
Провести анализ ДНК-белковых взаимодействий позитивного и негативного участков проксимального промотора генов CYP2BM2 с ядерными белками, изолированными из печени неиндуцированных животных при добавлении индукторов ФБ-типа в системе in vitro.
Научная новизна. Впервые с помощью гель-ратардационного анализа было исследовано формирование комплексов позитивного и негативного элементов гена CYP2B2 с ядерными белками от старта транскрипции до её завершенім (от б до 72 часов от начала введения индукторов). Показано, что в первые 6-9 часов после индукции оба исследуемых цис-активных элемента ведут себя согласно классической модели активации транскрипции генов СУР2В, описанной группой Падманабана (Rangarajan et al., 1995). В более поздние интервалы времени после индукции ТФД или ФБ (с 18 по 72 час), когда ген СУР2В транскрибируется, эта картина меняется. Негативный элемент начинает функционировать как позитивный элемент транскрипции, о чем свидетельствует динамика его взаимодействия с ядерными белками.
Продемонстрировано влияние индукторов ФБ-типа на формирование ДНК-белковых комплексов в системе in vitro. Впервые был зарегистрирован новый комплекс (N1), образованный позитивным элементом транскрипции и ядерными белками.
Впервые выявлено два новых ДНК-белковых комплекса (N11 и NIII), образованных под влиянием ТФД. Кроме этого, показано, что это соединение может напрямую взаимодействовать с позитивным элементом. На основа-кии экспериментальных данных предложена гипотетическая схема активации гена CYP2B2 при индукции ТФД.
Впервые при индукции ФБ и ТФД была продемонстрирована различающаяся динамика накопления мРНК для генов цитохромов Р450.
Обнаружены количественные различия в ферментативных активностях цитохромов Р450 подсемейства 2В в печени крыс, индуцированных ФБиТФД.
Практическая значимость. Использование в качестве индуктора лекарственного препарата ФБ уточняет представления о механизмах его действия. Обнаруженный факт взаимодействия ТФД с позитивным элементом гена CYP2B открывает новые перспективы для изучения активации генов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Активность CYP2B1 в метаболизме пентоксирезоруфина в печени крыс при индукции фенобарбиталом выше, чем при индукции трифениддиоксаном.
-
Динамика накопления мРНК генов CYP2B при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном различается.
-
Интенсивность связывания позитивного и негативного элементов генов CYP2B с ядерными белками печени крыс, обработанных как ФБ, так и ТФД не зависит от применяемого индуктора.
-
В течение длительного времени (с 9 до 72 часов после введения индукторов) интенсивность связывания негативного элемента с ядерными белками падает, затем возрастает, а к 72 часам достигает исходного уровня.
-
При индукции ТФД регистрируется пять ДНК-белковых комплексов, тогда как при ФБ - индукции только три.
-
ТФД инициирует образование ДНК-белковых комплексов, взаимодействуя с позитивным элементом.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на 11 международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Лос-Анжелес, США, 1996), VII Североамериканской конференции общества изучения чужеродных соединений (Сант-Диего, США, 1996), 10 Интернациональной конференции по изучению цитохрома Р450 (Сант-Франциско, США, 1997), на VIII конференции общества изучения чужеродных соединений (Южная Каролина, США, 1997), на 12 международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Монпелье, Франция, 1998), на 5 общей международной конференции общества изучения чужеродных соединений (Каирнс, Австралия, 1998).
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ. "*. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6-ти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методы исследований, собственные результаты, выводы и список литературы из 5 отечественных и 74 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 90 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 26 рисунками.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.