Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Свободные радикалы в патогенезе воспалительного процесса 9
1.1.1. Активные формы кислорода 9
1.1.2. Мишени для активных форм кислорода 14
1.1.3. Основные источники активных форм кислорода 16
1.1.4. Прооксидантный фермент - миелопероксидаза 17
1.1.5. Использование хемилюминесценции при изучении радикал-продуцирующей способности клеток 18
1.2. Классификация антиоксидантной защиты организма 19
1.2.1. Основные антиоксидантные ферменты 20
1.2.2. Антиоксидантная роль альбуминов крови 24
1.2.3. Механизм действия комбинации антиоксидантов: витамина Е, убихинона и селена 25
1.3. Особенности развития воспаления при хирургических способах 28
коррекции возрастных изменений лица и шеи
1.3.1. Основные хирургически способы коррекции возрастных изменений лица и шеи 28
1.3.2. Осложнений при подтяжке тканей лица 29
1.3.3. Развитие воспаления при хирургической травме 30
1.3.3.1. Влияние хирургической травмы на функциональное состояние полиморфноядерных лейкоцитов 31
1.3.3.2. Развитие воспаления в ране 33
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 36
2.1. Клинические методы исследования 36
2.2. Экспериментальные и лабораторные методы исследования 40
2.3. Реагенты 50
ГЛАВА III. Результаты исследований и обсуждение 51
3.1. Исследование природы люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови 51
3.2. Данные клинических исследований 56
3.2.1. Осложнения после косметических оперативных вмешательств 56
3.2.2. Влияние пластических операций на про- и антиоксидантные свойства крови 57
3.2.2.1. Влияние операции на элементы крови 57
3.2.2.2. Влияние операции на показатели плазмы 69
3.2.3. Влияние подтяжки тканей лица на оксидантные-антиоксидантные свойства кожи 74
3.3. Исследование эксцизионной раны в эксперименте 79
3.4. Исследование влияния комбинации антиоксидантов и аминокислот (КАА) на радикал-продуцирующую способность крови 86
Выводы 96
Список литературы 98
- Активные формы кислорода
- Механизм действия комбинации антиоксидантов: витамина Е, убихинона и селена
- Экспериментальные и лабораторные методы исследования
- Исследование природы люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови
Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с растущей популярностью пластических операций расширяются возрастные и социальные группы пациентов, подвергающихся подтяжке тканей лица. При этом в большинстве случаев не проводится тщательное обследование пациентов перед операцией, не ведется биохимический контроль состояния пациентов в постоперационном периоде, пребывание пациентов в стационаре ограничивается 1-2 сутками. Отсутствует также статистика по частоте осложнений после операций.
Реакция неспецифического воспаления в ответ на хирургическую травму зависит от объема вмешательства [Isozaki Н., 1999]. По современным представлениям в развитии воспалительного процесса большая роль принадлежит активным формам кислорода (АФК) и азота. При операциях подтяжки мягких тканей лица было выявлено повышение выработки моноцитами перекисных радикалов и фактора некроза опухоли (ФНО) [Панов В.В., 2001]. Известно, что ФНО является стимулятором «дыхательного взрыва» в полиморфноядерных лейкоцитах (ПМЯЛ) и их дегрануляции [Klebanoff S J., 1986]. Уровень радикал-продуцирующей активности ПМЯЛ может служить удобным критерием для мониторинга развития воспаления [Isozaki Н., 1999]. Снижение радикал-продуцирующей активности, в частности, в результате хирургического стресса, может повысить риск септических осложнений [Kehlet Н., 1998], поскольку активные формы кислорода и азота (в том числе и радикалы) обладают мощным бактерицидным потенциалом. Другая крайность -гиперактивация лейкоцитов - может повлечь за собой состояние окислительного стресса, характеризующееся окислительным повреждением собственных тканей и органов (в первую очередь, за счет перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран [Mealy К., 1987]). До сих пор не было известно, как влияет подтяжка тканей лица на функциональное состояние ПМЯЛ.
Основной причиной развития воспаления при пластических операциях является травма кожи и мягких тканей. Наиболее распространенными нежелательными последствиями операций по подтяжке тканей лица являются отеки, гематомы, экхимозы. Известно, что отеки сопровождаются хемотаксисом нейтрофилов в зону воспаления и генерацией АФК в коже [Nakamura Y., 1998]. В модельных экспериментах (эксцизионные раны у крыс) наблюдали усиление липидной пероксидации и рост активности антиоксидантного фермента каталазы в ткани раны [Звягинцева Т.В., 2000].
Оценка радикал-продуцирующей способности ПМЯЛ могла бы служить важным показателем степени и характера системной воспалительной реакции, вызванной хирургическим стрессом при пластической операции. Риск развития окислительных повреждений существенно возрастает при снижении активности собственных антиоксидантных систем организма, что характерно для тяжелых воспалительных процессов [Хараева З.Ф., 2003]. При этом наблюдается истощение пула низкомолекулярных антиоксидантов в плазме, снижение транспортной ёмкости альбумина в сыворотке [Степуро Й.И., 1994], отсутствие активации ферментов-антиоксидантов.
Цель исследования: изучить степень и динамику изменения радикал-продуцирующей активности и миграции в зону повреждения ПМЯЛ пациентов при пластических операциях по подтяжке тканей лица и оценить риск развития окислительного стресса в крови и коже пациентов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние подтяжки тканей лица на радикал-продуцирующую способность лейкоцитов в крови и миграцию их в оперируемую область кожи.
Исследовать процессы ПОЛ в плазме пациентов интраоперационно и в постоперационном периоде.
Определить уровень антиоксидантной активности плазмы и активности альбуминов сыворотки пациентов интраоперационно и в постоперационном периоде.
Оценить влияние подтяжки тканей лица на активность антиоксидантных ферментов в эпидермисе пациентов интраоперационно.
Исследовать в эксперименте на модели эксцизионной раны у крыс изменение продукции АФК лейкоцитами в крови и миграцию их в кожу.
Изучить динамику изменения активности антиоксиднатных ферментов кожи в модели эксцизионной раны у крыс.
Оценить возможность регуляции радикал-продуцирующей активности лейкоцитов с помощью экзогенных антиоксидантов при хирургическом стрессе.
Научная новизна. Впервые проведена оценка изменения радикал-продуцирующей активности лейкоцитов крови пациентов при пластических операциях в динамике (интраоперационно и в течение 7 дней после операции). Обнаружено интра- и постоперационное повышение радикал-продуцирующей активности ПМЯЛ, которое зависело соответственно, от продолжительности операции и срока с момента ее' начала. Выявлено снижение транспортной емкости сывороточного альбумина в конце операции и на первые сутки после операции. При этом не наблюдали достоверных изменений содержания продуктов липидной пероксидации — малонового диальдегида (МДА) - и снижения общей антиоксидантной активности в плазме.
Показано, что воспалительная реакция в эпидермисе пациентов характеризуется интраоперационньтм повышением уровня активности миелопероксидазы (маркерного фермента ПМЯЛ) и каталазы, зависящим от продолжительности операции. Отмечена тенденция к росту активности супероксиддисмутазы.
Исследована динамика общей и местной воспалительной реакции при эксцизионных ранах у крыс. Обнаружен подъем радикал-продуцирующей активности лейкоцитов крови на 4 сутки после операции, снижение общей антиокислительной активности плазмы и рост активности миелопероксидазы в прилежащих к ране участках кожи. На 4 сутки после операции в коже выявлен рост активности антиоксидантних ферментов — глутатион-пероксидазы (ГП) и глутатион-8-трансферазы (ГТ).
Показано, что профилактический прием комплекса на основе витаминов-антиоксидантов и аминокислот обладает способностью восстанавливать уровень общей антиокислительной активности плазмы и снижать уровень образования радикалов в крови при эксцизионных ранах у крыс после операции.
Практическая значимость результатов работы. Показано, что пластические операции по подтяжке тканей лица вызывают рост образования активных форм кислорода в крови, сопоставимый с эффектом абдоминальных операций. На основании анализа радикал-продуцирующей активности ПМЯЛ периферической крови пациентов дана оценка динамики общей воспалительной реакции. Обнаружено, что активация лейкоцитов компенсируется собственными защитными антиоксидантными системами организма, поскольку в плазме не увеличивалось содержание малонового диальдегида (конечного продукта липидной пероксидации) и не снижалась её' общая антиокислительная активность. В коже рост активности миелопероксидазы ПМЯЛ сопровождался ростом активности антиоксидантного фермента каталазы.
Показано, что активированное состояние лейкоцитов сохраняется как минимум в течение 3-х суток после операции, вследствие чего в этот период повышен риск острого воспалительного ответа на внешнее воздействие (инфекция, травма). К 7-м суткам выявлено снижение функциональной активности лейкоцитов, что увеличивает риск инфекционных осложнений.
В эксперименте показано, что с помощью профилактического приема комплекса витаминов-антиоксидантов и аминокислот можно уменьшить степень активации лейкоцитов крови после операции.
Обнаружено, что местная воспалительная реакция в коже сопровождается подъемом активности пероксид-утилизирующих ферментов. Этот результат может быть использован при направленном подборе местных противовоспалительных препаратов с антиоксидантным действием.
Активные формы кислорода
В организме ионы железа встречаются в довольно большом количестве (40-50 мг Fe/кг массы тела). Железо входит в состав таких белков как гемоглобин, миоглобин, цитохром, каталаза, пероксидаза, церрулоплазмин, ферритин и пр. В крови ионы железа находятся в связанной с трансферрином форме. Снижение количества железо-переносящих белков и повышение свободного железа крови может вести к образованию избыточного количества ОН , других свободных радикалов и ПОЛ [Beach D.C., 1992; Fukuzawa К., 1992; Fuhrmann В., 1994]. Однако замечено формирование гидроксильного радикала и под действием связанного железа в виде лактоферрина и трансферина [Klebanoff S.J., 1990], а также при действии гемоглобина на пероксид водорода. ОН" образуется также при микросомальном окислении как побочный продукт.
Гидроксильный радикал является сильным окислителем и вступает в химические реакции с биологическим субстратом практически на месте и в момент своего образования. Максимальное расстояние, на которое способен диффундировать этот радикал, не превышает двух диаметров его молекулы [Владимиров Ю.А., 1987]. ОН" может модифицировать белки: остатки триптофана альбумина сыворотки повреждаются OH /Fe+2 [Miura Т. et al, 1992; Uchida К. et el, 1989]. ОН" индуцирует ПОЛ, от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные липиды мембран. В результате цепных реакций возникают множественные нарушения структуры мембран, что приводит к гибели клеток. Так, рядом авторов показано, что под действием OH7Fe+2 повреждаются изолированные митохондрии крысы [Zglinicki Т., 1993; Hermes-Lima М., 1995]. 4) Монооксид азота NO обладает большим количеством регуляторных функций. Он является медиатором, нейротрансмиттером, паракринной суб-станцией. В роли медиатора монооксид азота действует благодаря свойствам вторичного посредника (активирует растворимую гуанилатциклазу, продукт которой - цГМФ). N0 проявляет вазодилятаторные свойства и удерживает тонус стенки бронхов на низком уровне [Зуга В.И., 1998]. Другие функции N0 опосредованы его взаимодействием с металлами переменной валентности, тио-ловыми группами, другими свободными радикалами, кислородом, насыщенными жирными кислотами. В результате из NO образуются нитриты и нитраты, под действием которых изменяется структура белков, их функция, в том числе ферментативная способность [Murad F., 2004]. Монооксид азота синтезируется конституциональными и индуцибельными NO-синтазами из L-аргинина в присутствии кислорода и НАДФН. Содержание монооксида азота в тканях регулируется супероксид-анионом, который может, как повышать содержание N0, активируя NO-синтазу, так и снижать, превращая его в пероксинитрит (ONO2") (6) [Реутов B.IX, 1995]: Пероксинитрит благодаря отсутствию неспаренных электронов является достаточно стабильным соединением. Он проявляет цитотоксические свойства за счет окисления SH-групп, липидов, ДНК и белков [Проскуряков С.Я., 2000; Beckman J.S., 1994; Breland J.K., 1995]. Как избыток, так и недостаток монооксида азота приводит к развитию ряда патологических изменений при диабете, сердечно-сосудистых заболеваниях, старении [Голиков А.П., 2003]. 1) Реакции переписного окисления липидов (ПОЛ). Основным компонентом липидной фазы клеточных и субклеточных мембран являются фосфолипи-ды, имеющие относительно высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот [Singlair Н.М., 1984]. Именно это делает их весьма чувствительными к различным внешним воздействиям [Арчаков А.И., 1975]. Существенная роль в процессе разрушения биомембран принадлежит усилению в них ПОЛ. Под ПОЛ понимают окисление липидов посредством присоединения двух атомов кислорода по двойным связям ненасыщенных жирных кислот, с образованием пероксидов и свободных радикалов. Способностью запускать ПОЛ обладают супероксид-анион [Острахович Е.А., 1994], гидроксильный радикал, синглет-ный кислород, пероксид водорода и ионы Fe2+ в низких концентрациях [Slater T.F., 1987], НОС1/ОСГ [Панасенко О.М., 2002]. В результате ПОЛ образуются шиффовы основания, перекисные радикалы, коньюгированные диены, альдегиды (конечный продукт - МДА). Бесконтрольное увеличение ПОЛ может привести к тяжелым последствиям: повреждению ДНК [Bartsch Н., 2005], нарушению трансмембранного потенциала, разбуханию клетки и увеличению концен-трации внутриклеточного Са . Подобное увеличение проницаемости мембран органелл клетки приводит к перераспределению ионов и проявляется в патологических внутриклеточных процессах. Например, увеличение концентрации ионов Са внутри митохондрий вызывает апоптоз [Beattie D.S., 2002]. 2) Повреждение белков. Гипохлорит ион и гидроксильный радикал способны атаковать тиоловые и аминогруппы, вызывая окислительную модификацию белков и разрыв пептидных связей. Альдегидные группы диеновых соединений, а также малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль, которые являются вторичными продуктами ПОЛ, также реагируют с аминокислотными остатками белков и нуклеотидами. Под воздействием АФК металопротеины могут терять металл [Aruoma O.I., 1996]. 3) Повреждение нуклеиновых кислот. Под воздействием АФК возможны: отрыв атома водорода и повреждение сахарного остатка в составе нук-леозидов [Harman D., 1992]; присоединение к молекулам по двойным связям и взаимодействие с пуриновыми и пиримидиновьши основаниями в составе ДНК и РНК, в том числе с образованием вторичных радикалов [Jaruga Р., 1994, Ri-som L., 2005]. Результатом таких воздействий могут быть мутация клетки и/или её гибель. Основные источники активных форм кислорода АФК образуются во всех клетках, использующих кислород для дыхания. Наиболее мощным генератором АФК в организме являются лейкоциты [Коган А.Х., 1991; ВаЫогВ.М., 1984], особенно нейтрофилы [Gabing Т.М., 1979; Varani J., 1994; Wahi S.,1991], и в меньшей степени эозинофилы [Koenderman L., 1987], моноциты [Nelson R.D., 1976] и лимфоциты [Allen R.C., 1976]. Генерировать АФК могут также тромбоциты [Warner Р., 1981] и эритроциты [Усмакова Г.Я., 1999].
Механизм действия комбинации антиоксидантов: витамина Е, убихинона и селена
Для терапии и профилактики оксилительного стресса в организме человека используются антиоксидантные соединения. Экспериментальные работы показали высокую эффективность комбинации антиоксидантов: витамина Е, убихинона и селена [Виноградова Л.Ф., 1990].
В основе механизма действия витамина Е, KoQ и Se лежит способность ингибировать процессы ПОЛ. Витамин Е и KoQ являются антирадикальными ингибиторами, которые реагируют непосредственно с пероксидными радикалами полиненасыщенных жирных кислот. Высокое сродство витамина Е и KoQ к пероксидным радикалам обусловлено наличием в молекулах этих веществ лабильных гидроксильных групп. Функция витамина Е и KoQ состоит в замене активных радикалов на менее активные радикалы ингибитора, что ведет к нейтрализации активных свободных радикалов в моменты их образования и обрыва цепи свободнорадикального окисления [Zhu Q.X., 2005]. Витамин Е и KoQ являются важными компонентами биоантиоксидантной системы, регулирующей скорость окисления липидов биомембран. Указанные антиоксиданти участвуют в поддержании структурно-функциональной устойчивости биомембран. Встраиваясь гидрофобной боковой цепью в структуру липидного бислоя, они изменяют его текучесть. Витамин Е и KoQ увеличивают плотность упаковки фосфолипидных мембран и препятствуют проникновению кислорода к липид-ным слоям, уменьшая скорость ПОЛ. Селен, являясь активным центром ГП, участвует в процессах детоксикации перекисных соединений, повышает активность этого фермента, снижая активность кислой фосфатазы и катепсина - ли-зосомальных ферментов, которые участвуют в повреждении клеток [Behne D., 2001]. Селен способствует синтезу ГП и стимулирует выработку эндогенных антиоксидантов [Cheng W.H., 1997; Matsuda А., 1998]. Указанные антиокси-дантные свойства селена обуславливают мембраностабилизирующее действие его солей.
При применении комбинации антиоксидантов - витамина Е, KoQ и Se -наблюдается усиление антиоксидантного эффекта. Это усиление обусловлено их тесным взаимодействием. Витамину Е отводится структурная и защитная роль в отношении липидов биомембран и селенида, входящего в состав не ге-мовых железосодержащих белков мембраны, в частности ГП. В то же время витамин Е осуществляет биохимический контроль за метаболизмом KoQ [Emster I., 1993]. Установлена прямая зависимость между обеспеченностью организма витамином Е, селеном и интенсивностью биосинтеза убихинона. Витамин Е и селен улучшают использование убихинона клетками. Влияние селена на повышение уровня KoQ в тканях связано с тем, что он сам и его производные необходимы для абсорбции витамина Е, который участвует в биосинтезе KoQ de novo. Применение комбинации указанных антиоксидантов способствует улучшению обмена метионина, активирует синтез глутатиона и использование его в процессах детоксикации гидроперекисей глутатионпероксидазной системой.
Таким образом, из приведенного выше краткого обзора основных компонентов про- и антиоксидантных систем человека крови видно, что вместе они составляют сложную систему, осуществляющую многоуровневую регуляцию реакций свободнорадикального окисления. За последние годы накопилось большое количество экспериментальных данных, доказывающих участие свободных радикалов в развитии воспалительного процесса. Истоки эстетической хирургии следует искать в медицине древней Индии, Египта, Ирана [Сорокина Т.С., 1994], но официальной датой её рождения можно считать 1912 г., когда немецкий хирург Йозеф Голлендер впервые в мировой литературе описал технический принцип хирургической коррекции старческих изменений лица и шеи [Эйтнер Э., 1936]. В настоящее время подтяжка мягих тканей лица является очень популярной операцией, используемой для ликвидации птоза и удаления избытков мягких тканей. В современной хирургии принято выделять следующие основные типы операций в пластике лица: 1) Простая кожная шейно-лицевая подтяжка по Skoog Т. (1963), когда поверхностная фасциально-мышечная система (ПФМС) отслаивается от кожи шеи и лица. 2) Расширенная подтяжка мягких тканей лица с подтяжкой ПФМС, при этом сначала поднимается кожа, а затем ПФМС [Owsley J. 1977]. 3) Комбинированная или глубокая подтяжка, во время которой вместе с лоскутом, состоящим из кожи и ПФМС, поднимается жировая ткань, расположенная над скуловыми мышцами [Hamra S., 1990]. 4) Подтяжка верхних двух третей лица или сложная подтяжка. Передвигается лоскут, состоящий из ПФМС, жировой ткани и круговой мышцы глаза [Hamra S., 1992].
Экспериментальные и лабораторные методы исследования
Выделение плазмы. Для выделения плазмы венозную кровь центрифугировали 10 минут при 400g и собирали супернатант.
Выделение лейкоцитов. Лейкоциты выделяли по стандартной методике на градиенте плотности. Для этого в пластиковые пробирки поэтапно наслаивали раствор фикол-верографин (удельная плотность 1,119 г/мл) и 5-6 мл периферической крови. Затем пробирки центрифугировали в течение 40 минут при 800 g. После центрифугирования лейкоциты концентрировались в интерфазном кольце (рис. 2.1а). Взвесь лейкоцитов переносили в чистые пробирки и дважды отмывали изотоническим раствором. Режим центрифугирования 10 минут при 400 g. Для лизиса примеси эритроцитов к клеточному осадку добавляли 900 мкл ледяной дистиллированной воды, хорошо перемешивали и добавляли 100 мкл 9% раствора NaCl. Далее доводили объем изотоническим раствором до 10 мл и центрифугировали. Отмытый осадок лейкоцитов ресуспензировали в 1 мл стандартного раствора Хенкса (рН 7,4). Хранили при +4 С в течение 5-6 ч.
Выделение ПМЯЛ проводили на двух градиентах плотности: в одноразовую пробирку помещали 2 мл градиента плотности 1,119 г/мл, на него наслаивали 2 мл градиента 1,077 г/мл. Сверху наслаивали 3-4 мл цельной крови. После центрифугирования в отдельную пробирку выделяли слой клеток, образующих нижнее кольцо (ГТМЯЛ) (рис. 2.16). Далее клетки промывали, как описано выше.
Взятие образцов кожи у пациентов Образцы кожи были получены в результате её иссечения в ходе операции. Образцы кожи по времени иссечения были сгруппированы в три группы: 1) 5-15 минут после начала операции; 2) 30-150 минут после начала операции; 3) 150-250 минут после начала операции. Приготовление супернатанта гомогенати изолированного эпидермиса кожи Образцы кожи хранили при -18 С. Перед проведением анализов эпидермис соскребали, не размораживая образцы, промывали калий-фосфатным буфером рН=7,4 и гомогенизировали в ручном стеклянном гомогенизаторе Поттера. Затем гомогенаты центрифугировали (1000 g, 30 мин) при 10 С. Микроскопические исследования осадка показали, что в результате этой процедуры практически все клетки были разрушены. Экспериментальная модель полнослоинои экщизионной раны у крыс Опыт проводили на 16 крысах самцах линии Вистар массой 200-220 г, находящихся на обычном рационе питания. Полнослойную эксцизионную рану моделировали путем вырезания двух квадратов 15x15 мм с левой и правой стороны спины животного после выбривания шерсти (под общей анестезией). Кожу вырезали с подкожно-жировой клетчаткой. Длительность этой операции составляла 15 минут. Перевязки проводили под эфирным наркозом в течение 8 дней. При этом каждый раз очищали рану стерильным физиологическим раствором и накладывали свежую герметичную повязку Tegaderm. До операции, на 1-й, 4-й и 8-й день у крыс забирали кровь (50 мкл) из хвостовой вены. В цельной крови измеряли ХЛ, стимулированную ФМА. Биоптаты полнослоинои кожи забирали на 4 и 8 сутки из зоны, прилежащей к ране. В супернатанте го-могената кожи оценивали уровень активности МПО, ГП, ГТ. Эффективность комбинации антиоксидантов и аминокислот (КАА) при терапии воспаления, вызванного эксцизионнои раной, оценивали на основании измерения ХЛ цельной крови и АОА плазмы у крыс. Животные были разделены на 2 экспериментальные группы. Опытной группе per os вводили КАА в дозе 100 мг/кг два раза в день на протяжении 6 дней: за 4 дня до операции, в день операции и на 1-е сутки после операции. Суточная доза КАА содержала 11 мг убихинона, 11 мг витамина Е, 44 мг L-метионина, 11 мг аспартата селена и 123 мг соевого фосфолипидного комплекса. Контрольной группе per os вводили 0,9% раствор NaCl по той же схеме. Для измерения ХЛ у животных забирали кровь (50 мкл) из хвостовой вены в следующие моменты времени: до операции, после введения наркоза, в конце операции и на 1-е сутки после операции. Животных декапитировали на 1-е сутки после операции и в плазме крови определяли АОА. Определение СОЭ СОЭ определяли по унифицированной микрометодике Панченкова [Мед.лаб.технологии, том 1, с. 283-284]. Отличие было в том, что кровь, взятая на анализ, уже содержала антикоагулянт гепарин, поэтому в капилляр набирали кровь из пробирки до отметки «К» без добавления цитрата натрия.
Исследование природы люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови
В следующем эксперименте анализировали характер зависимости между функциональным состоянием лейкоцитов и ХЛ. Для этого у здоровых доноров измеряли ХЛ цельной крови (в пробу добавляли 10 мкл крови с содержанием лейкоцитов 5,9+0,8 х104 клеток/мл), и ХЛ выделенных лейкоцитов (в пробу добавляли 0,5 х10б лейкоцитов). В результате была обнаружена прямая корреляция между величиной ХЛ ответа в цельной крови и ХЛ ответом выделенных лейкоцитов г=0,59; п=24; р=0,003 (рис. 3.2).
В норме примерно 45-70% от общего числа лейкоцитов составляют ПМЯЛ. Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение вклада нейтрофилов в суммарную продукцию радикалов лейкоцитами. В результате корреляционного анализа удельной ХЛ изолированных лейкоцитов и ПМЯЛ обнаружена связь между радикал-продуцирующей способностью нейтрофилов и лейкоцитов г=0,81; п=50; р 0,001 (рис. 3.3).
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что ХЛ цельной крови прямо зависит как от количества ПМЯЛ в пробе, так и от их активности.
Представляло интерес выяснить, какие свободные радикалы отвечают за ХЛ в цельной крови, так как на разных этапах воспалительного процесса в организме вырабатывается разный спектр АФК и азота. Известно, что переход люминола в возбужденное состояние с последующим испусканием кванта света происходит в реакциях его с супероксидным радикалом, гидроксильным радикалом, пероксидами и липопероксидами, пероксинитритом, гипохлоритом и др. [Faden Н., 1981; Токмаков А.А., 1991]. ХЛ может быть обусловлена как внутриклеточной, так и внеклеточной продукцией радикалов, поскольку люминол является небольшой молекулой, легко проникающей внутрь клетки через мембрану [Dahlgren С, 1985]. Для исследования роли основных путей генерации АФК нейтрофилами в ХЛ цельной крови был использован ингибиторный анализ.
Пробы донорской крови стимулировали ФМА и измеряли ЛЗ ХЛ в присутствии различных концентраций ингибиторов. В качестве ингибиторов использовали: 1) азид натрия - ингибитор МПО, каталазы и перехватчик синглетного кислорода; 2) таурин — ловушку гипохлорида; 3) СОД — фермент, осуществляющий превращение внеклеточно генерируемого супероксида в пероксид водорода; 4) каталазу - фермент, разлагающий внеклеточно генерируемый пероксид водорода; 5) L-NAME — ингибитор NO-синтазы [Li C.G., 1991 ]; 6) нордигидрогуаретовую кислоту (НДГА) - ингибитор липоксигеназы [Morris H.R,, 1980]; 7) маннитол — ловушку гидроксильного радикала. В таблице 3.1 суммированы результаты ингибиторного анализа. Указана концентрация ингибитора, вызывающая уменьшение интенсивности свечения системы на 50% (С5о%).
Полученные данные свидетельствуют о существенном вкладе в ингибирование ХЛ цельной крови (в норме) азида натрия и таурина, что подтверждает важную роль миелопероксидазнои реакции в генерации свободных радикалов, усиливающих ХЛ. Эти результаты согласуются с данными, полученными для выделенных нейтрофилах [Токмаков А.А., 1991]. Еще одним источником ХЛ служит реакция люминола с пероксинитритом, что доказывает дозозависимый ингибирующий эффект L-NAME, и активация липоксигеназы с образованием липопероксидов, о чем свидетельствует дозозависимое ингибирование ХЛ ответа НДГА.
В то же время не было обнаружено ингибирующего эффекта внеклеточной СОД и каталазы, что указывает на незначительный вклад прямой внеклеточной реакции супероксид-аниона и пероксида водорода с люминолом в суммарную ХЛ, Однако,эти радикалы необходимы для ферментативных реакций с образованием других АФК. Так, Н2О2 необходим в качестве субстрата для МПО, а супероксид-анион участвует в образовании пероксинитрита. То есть, возможно, существует конкуренция ферментных систем за пероксид водорода (МПО, каталазы) и супероксид-анион (N0-синтазы, СОД). В результате с люминолом реагируют продукты миелопероксидазной и NO-синтазной реакции.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что источником ЛЗ ХЛ цельной крови в норме служат реакции люминола с образованием таких АФК, как гипохлорита, липопероксидов и оксида азота, т.е. позволяет регистрировать широкий спектр радикалов.
Таким образом, оценка люминол-активированной ХЛ цельной крови является удобным и адекватным методом измерения радикал-продуцирующей активности лейкоцитов в присутствии других компонентов крови.
