Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ 1
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 2
ВВЕДЕНИЕ 3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
Система Fas/FasL 6
Структурно-функциональные особенности Fas-рецептора 6
Структурно-функциональные особенности Fas лиганда 9
Механизмы передачи апоптотического сигнала через Fas рецептор 12
Механизм формирования сигнального комплекса 12
Механизм передачи сигнала, опосредованный комплексом Fas/FADD...15
Молекулярные механизмы передачи сигнала, опосредованные
взаимодействием Fas-рецептора с другими белками 18
Механизмы устойчивости к Fas-опосредованному апоптозу 21
«Обратная сигнализация», запускаемая рецепторами семейства ФНО 25
Дефекты апоптоза при системной красной волчанке и ревматодном артрите 30
Система Fas/FasL при СКВ и РА 36
ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
Общая характеристика больных РА 41
Общая характеристика больных СКВ 43
Получение экспериментального материала и методы исследования 44
Оборудование и реактивы 45
Методы 47
Разработка тест-системы на основе МКА для исследования концентрации sFasB сыворотке крови 47
Исследование экспрессии генов Fas и sFas в лимфоцитах крови 52
МТТтест 53
Анализ цитотоксичности по прокрашиванию клеток нейтральным красным 54
Анализ растворимого Fas рецептора в сыворотке крови 54
Исследование экспрессии FasL на поверхности клеток синовия и лимфоцитов крови 55
Статистическая обработка 55
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 56
Разработка тест системы типа «сэндвич» на основе моноклональных антител для определения концентрации растворимого Fas-рецептора в сыворотке крови 56
Исследование концентрации sFas-рецептора в сыворотке крови больных РА, СКВ и
здоровых доноров 58
Взаимосвязь уровня sFas в сыворотке крови больных РА и СКВ с клиническими
характеристиками больных 59
Исследование структурных особенностей и цитотоксической активности растворимого
Fas-рецептора в сыворотке крови 66
Выявление типов клеток - потенциальных мишеней для sFas у больных РА и СКВ 69
ВЫВОДЫ 74
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 75
Введение к работе
Апоптоз или программируемая клеточная гибель - нормальный физиологический процесс гибели клетки, который протекает при следующих морфологических изменениях: уменьшение размеров клетки, конденсация хроматина, нуклеосомная фрагментация ДНК и формирование апоптотических телец. Такой регулируемый процесс клеточной гибели играет важную роль в процессе эмбриогенеза, поддержании гомеостаза и перестройке тканей, обеспечивает удаление ненужных и потенциально опасных клеток, таких как аутореактивные лимфоциты, опухолевые клетки, клетки с нерепарируемыми повреждениями ДНК или клетки, инфицированные вирусами. Нарушения процессов апоптоза играют ключевую роль в развитии нейродегенеративных, вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваниий.
В регуляции пролиферации, дифференцировки, клеточной гибели важную роль играют семейства рецепторов Фактора некроза опухоли (ФНО) и соответствующих лигандов. Часть этих функций реализуется в результате активации трансмембранных рецепторов лигандами (растворимыми или трансмембранными) и последующей передачи сигнала в клетку, которая несет рецептор. Другие функции реализуются посредством так называемой «обратной сигнализации», при которой рецептор (растворимый или трансмембранный) выполняет роль лиганда, а трансмембранный лиганд выступает в качестве рецептора. Практически для всех членов семейств ФНО-рецепторов и ФНО-лигандов показаны биологические эффекты «обратной сигнализации» на различных типах клеток (Eissner et al., 2004; Глухова и др., 2006).
Fas-рецептор и Fas-лиганд являются членами семейств рецепторов ФНО и лигандов ФНО, соответственно, и играют ключевую роль в поддержании гомеостаза иммунной системы. Активация трансмембранного Fas-рецептора Fas-лигандом лежит в основе селекции Т- и В-лимфоцитов, уничтожения клеток-мишеней цитотоксическими лимфоцитами. Активация трансмембранного Fas-рецептора растворимым или трансмембранным Fas-лигандом в большинстве случаев приводит к гибели клеток по типу апоптоза. Для системы Fas/FasL была также продемонстрирована возможность проведения обратного сигнала через трансмембранный FasL (Desbarats et al., 1998; Suzuki, Fink, 2000; Prusakova et al., 2003).
Большое количество патогенных состояний, в частности аутоиммунных, связано с нарушением функционирования системы Fas/FasL. При некоторых аутоиммунных заболеваниях, в том числе при системной красной волчанке (СКВ) и ревматоидном артрите (РА), уровень растворимого Fas-рецептора (sFas) в сыворотке крови больных повышен по сравнению со здоровыми донорами (Cheng et al., 1994; Christensson et al., 2002; Ates et al., 2004; Sahin et al., 2007). Было сделано предположение о том, что растворимый Fas конкурирует с мембранно-связанным Fas-рецептором за связывание с лигандом и является ингибитором Fas-опосредованного апоптоза (Cheng et al., 1994; Tokano et al., 1996; Hasunuma et al., 1997).
Однако в работах других авторов показано, что увеличение уровня растворимого Fas-рецептора в сыворотке крови больных СКВ и РА коррелирует с количеством апоптотических лимфоцитов (Courtney et al., 1999; Smolewska et al., 2003; Silvestris et al., 2003). Было обнаружено, что инкубация с sFas значительно подавляет пролиферацию Т-клеток. Основываясь на этих наблюдениях, можно полагать, что sFas вызывает проапоптотический эффект. Проапоптотические эффекты sFas, как было показано ранее, реализуются посредством «обратной сигнализации» через Fas-лиганд. В настоящей работе была предпринята попытка изучить возможную роль sFas, как индуктора Fas-лиганд - опосредованной «обратной сигнализации» в патогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Цель работы заключалась в исследовании роли растворимого Fas-рецептора в патогенезе ревматоидного артрита и системной красной волчанки.
