Введение к работе
Актуальность проблемы, Доставка чужеродного генетического материала в эукариотические клетки является одной из актуальных проблем современной клеточной биологии, биотехнологии и медицины. О высоком интересе к этой проблеме свидетельствует большое количество имеющихся на данный момент методов трансфекцни - более четырех десятков, не считая различных модификаций. Однако, ни один из известных методов трансфекцни не может быть использован без существенных ограничений для решения прикладных медицинских задач, в частности такой, как компенсация генетических дефектов в отдельных соматических клетках (генокоррекция) на уровне целого многоклеточного организма. Это объясняется тем, что почти все существующие методы трансфекция являются либо неспецифическими (по характеру взаимодействия ДНК-транспортирующих частиц с цитоплазматической мембраной клеток) и нецеленаправленными (по способу транспорта экзогенной ДНК в ядра трансфеЗируемых клеток), либо технически сложными или повреждающими клетки, либо принципиально не могут быть использованы в экспериментах in vivo.
Специфическим, целенаправленным и неповреждающим образом транспортируют свой генетический материал в клетки вирусы (Fields, Knipe, 1990), но и использование вирусов и вирусных частиц, собранных in vitro, для переноса экзогенной ДНК в клетки также накладывает ряд ограничений в силу того, что вирусы являются многофункциональными образованиями и находящиеся в их составе компоненты обладают рядом нежелательных функций, помимо необходимых для экспериментаторов (Strauss et al., 1986). Поэтому, оправданої на наш взгляд, являемся попытка создать более простые растворимые молекулярные конструкции, моделирующие только положительные свойства вирусов. Для многих вирусов, как частиц, специализированных на переносе генетической информации в ядро клеток-хозяев, характерно наличие структур, специфически узнаваемых интеркализуемым клеточным рецептором; присутствие сигнальной последовательности, обеспечивающей транспорт вирусного генома в ядро и, наконец, обратимое взаимодействие нуклеиновой кислоты с транспортирующими ее молекулами (Fields, Knipe, 1990). Молекулярные конструкции, обладающие такими же свойствами, могут состоять из полианиона, такого как ДНК, нековалентно взаимодействующего с
поликатионом, к которому ковалентно присоединены компоненты, обеспечивающие как связывание с интернализуемым клеточным рецептором,, так и транспорт в ядро клетки-мишени. При таком подходе появляется возможность легко менять как тип клеток-мишеней, так и нуклеиновые кислоты в составе этих конструкций.
Известно (IJ et al., 1973), что ДНК нековалентно связывает поликатионы, в частности, полн-.-лизии, который может быть' модифицирован при помощи различных бифункционально-сшивающих реагентов, причем ПОЛИ-І.-ЛИЗИН при взаимодействии с ДНК образует растворимые комплексы. Удобным, на наш взгляд, лигандом в такой конструкции является инсулин, так как он, во-первых, специфически связывается и интернализуется клетками путем рецептор-опосредованного эндоцитоза через инсулиновые рецепторы (Pehlmann et al., 1982), а во-вторых, может непосредственно транспортироваться в клеточные ядра (Smith, Jarett, 1990).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было создание растворимой молекулярной конструкции, способной избирательно и целенаправленно доставлять чужеродный генетический материал в ядра клеток-мишеней путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и цито-плазменнр-ядерного транспорта.
В задачи исследования входило:
-
Синтезировать конъюгат инсулин-поли-/--лизин, способный образовывать комплексы с плазмидными ДНК.
-
Определить оптимальные условия хомплексообразования коньюгата инсулия-поли-1.-лизин с плазмидными ДНК, при которых образуются растворимые молекулярные конструкции инсулин-поли-і-лизин-плазмида.
-
Определить параметры специфического связывания и эндоцитоза инсулина в выбранных клетках-мишенях.
-
Оценить способность растворимой конструкции инсулин-поли-і-ли-зин-плазмидная ДНК специфически связываться с инсулиновыми рецепторами клеток-мишеней.
-
Исследовать рецептор-опосредованный эндоцитоз и внутриклеточный транспорт растворимой конструкции инсулин-поли-Л-лизин-плазмида в выбранных клетках-мишенях.
-
Осуществить трансфехцию клеток-мишеней, имеющих эндоцитиру-емые инсулиновые рецепторы, с помощью растворимой молекулярной конструкции инсулнн-поли-і-лизин-плазмидная ДНК.
Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые было показано, что искусственно синтезированная растворимая молекулярная конструкция инсулин-поли-Л-лизин-плазмидная ДНК специфически и с высоким сродством связывается с инсулиновыми рецепторами клеток гепатомы человека линии PLC/PRF/5, а затем путем рецептор-опосредованного эндоцитоза интернализуется этими рецепторами и специфически транспортируется в кислые внутриклеточные компартменты. Важность данного исследования также заключается в том, что впервые продемонстрирована возможность с помощью растворимой молекулярной конструкции инсулин-поли-//-лизин-плазмида специфически, посредством инсулиновых рецепторов доставлять чужеродный генетический материал в ядра соматических клеток и, как следствие, трансформировать эти клетки.
Практическая значимость исследования, Выполненная работа имеет важное научное и практическое значение, так ках создание растворимых молекулярных конструкций такого ' класса, способных селективно доставлять чужеродную ДНК в ядра клеток-мишеней, в перспективе может розводить решать проблемы генокоррекции - компенсации генетических дефектов в отдельных соматических клетках на уровне целого многоклеточного организма.
Апробация работы. Научные результаты, представленные в диссертации были доложены на Совещании по медицинской биохимии (Москва, 1988), на 3-м Европейском конгрессе по клеточной биологии (Флоренция, Италия, 1990), на семинаре Института биофизики общества им. М. Планка (Франкфурт-на-Майне, ФРГ, 1990), на 1-3-й Всесоюзных конференциях по направлению ."Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1990-1992), на. 15-м Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, Израиль, 1991), на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (С.-Петербург, 1991), на семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ (Москва, 1991), на семинаре Института биохимии Йенского Университета им. Ф. Шиллера (Йена, ФРГ, 1992), на Всесоюзной конференции "Биология -клетки в культуре" (С.-Петербург, 1992). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре во Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения (Москва, 1992).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ з отечественной и зарубежной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на .122 страницах мапшиошсного текста и иллюстрирована 15 рисунками и 1 таблицей.