Содержание к диссертации
Введение
I. ОБРАЗОВАНИЕ И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЫ ЛРОТОХЛОРОФИЛЛА В ЭТИОЛИРОВАННЫХ ЛИСТЬЯХ (литературный обзор)
1. О спектральных изменениях в процессе образования 6
2. Физико-химическое состояние и ультраструктура этиопластов в связи со спектральными свойствами..,. 28
II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 43
III. НАТИВНЫЕ СПЕКТРАЛЬНЫЕ ФОРМЫ ПИГМЕНТА И ИХ УЧАСТИЕ В ПРЕВРАЩЕНИИ В ПЕРВИЧНЫЙ ХЛОРОФИЛЛ-БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС
1. Формирование фонда молекул. 50
2. Изменение спектральных свойств в процессе образо- зания и фотовосстановления
а) На ранней стадии развития 55
б) При максимальном накоплении протохлорофиллида
650 65
в) При отрицательной температуре... 73
1V.ФИЗИК0-ХИМИЧЕСК0Е СОСТОЯНИЕ ПР0ТОХЛОР0ФИЛЛ0ВОГ0
ПИГМЕНТА ЭТИОЛИРОВАННЫХ ЛИСТЬЕВ
1. С разным соотношением спектральных форм 98
2. В интактных листьях разного возраста 100
3. В условиях энзиматической дезактивации пигмента... 103
4. Неактивного протохлорофиллида, образовавшегося из экзогенной аминолевулиновой кислоты. 111
5. В процессе образования хлорофилла 670 постэтиоли-рованных листьев. 115
V. ЭЛЕКТРOННОМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ЭТИОПЛАСТА
1. В условиях доминирования длинноволновой формы протохлорофиллового пигмента 120
2. При доминировании коротковолновой формы . 124
VI. ИЗМЕНЕНИЕ СООТНОШЕНИЯ СПЕКТРАЛЬНЫХ ПРОТОХЛОРОФИЛЛОВОГО ПИШЕНТА И УЛЬТРАСТРУКТУРА ШГАСТВД ВНУТРЕННИХ ОБОЛОЧЕК СЕМЯН ТЫКВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
1. Постановка задачи 135
2. Формирование пигментного фонда .. 137
3. Набор спектральных форм и их изменение в нативном состоянии. І4Ї
4. Ультраструктура пластид 143
УП. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Л 150
ВЫВОДЫ 157
ЛИТЕРАТУРА 159
- О спектральных изменениях в процессе образования
- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
- Формирование фонда молекул.
- С разным соотношением спектральных форм
- В условиях доминирования длинноволновой формы протохлорофиллового пигмента
Введение к работе
Раскрытие механизма фотосинтеза является одной из важнейших задач современной биологии. Изучение процесса биосинтеза пигментов приобретает особое значение для выявления строения фотосинтетического аппарата, формирования его фотосистем, что необходимо для перехода к направленному воздействию на процесс фотосинтеза с целью повышения продуктивности растений. К настоящему времени благодаря работам многих исследователей у нас в стране и за рубежом сформировались фундаментальные представления о процессе биосинтеза пигментов фотосинтетического аппарата и его тонкой структуры (Годнев, Вечер, Шлык, Тагеева, Калер, ОсИПОВа, Granick, Bogorad и др.), фотофизи-ческих и фотохимических (Красновский, Евстигнеев, Рубин, Литвин, Butler, Griffiths и др.), биохимических и физиологических (Ничипорович, Мокроносов, Тарчевский, Воскресенская, Иванченко, Чайка и др.,) и генетических (Насыров и др.) аспектов процесса фотосинтеза и его эндогенной и экзогенной регуляции.
Одной из удобных, широко используемых моделей для исследования биосинтеза хлорофилла и биогенеза фотосинтетического аппарата в высших растениях являются выросшие в отсутствие света проростки, где вследствие незначительного (по сравнению с зелеными) содержания пигментов появляется возможность изучить тонкий механизм работы и структурную организацию пигментного аппарата на начальных стадиях его формирования. Внимание исследователи постоянно привлекает предшественник хлорофилла -протохлорофиллид, соединенный в мембране с белком в комплексе, получившем название протохлорофиллид-голохром и, предположительно локализованном в особой структуре этиопласта - прола- меллярном теле. Исследования, проведенные академиком АН БССР Т.Н.Годневым, явились основой для изучения этого комплекса в интактных этиолированных листьях разных растений, поскольку он под действием света превращается в хлорофилл(ид) через несколько стадий. Так, окончательно не выяснены и требовали дальнейших исследований не только механизм превращения форм протохлорофиллового и хлорофиллового пигментов, последовательность их возникновения в процессе фотовосстановления прото-хлорофиллида, но и природа, состояние связи пигмента с липид-белковым носителем и изменение ультраструктуры этиопласта при его трансформации в хлоропласт.
О спектральных изменениях в процессе образования
К началу 60-х годов благодаря многочисленным исследованиям стало ясно, что протохлорофилловый пигмент этиолированных растений - в принципе единое вещество у всех растений, представляет собой монометиловый эфир Mg-винил феопорфирин а и является предшественником хлорофиллового пигмента.
При . исследовании пигмента, найденного во внутренних оболочках семян тыквенных растений /Монтеверде, Любимей-ко, I9II/, обнаружились различия в спектральных свойствах (в положении максимума Соре) зависимые от степени созревания семян /Годнев, Акулович, I960 б,г/, а также связанные по мнению этих авторов с небольшими отличиями в структуре боковых заместителей. Это, однако, подтвердилось не для всех видов тыквенных /Судьина, Голод, 1970/. Различия также отмечены в поведении указанных пигментов на хроматограмме /Судьина, Лозовая, 1961; Щдык и др., I960/.
Станиер /1962/ также нашел спектральные различия в полосе Соре спектра поглощения компонента пигмента тыквенных, совпадающие с аналогичными свойствами бактериального прото-хлорофиллида. Б связи с чем возникло предположение, что этот пигмент является подобным промежуточным продуктом в биосинтезе бактериохлорофилла /Годнев и др., 1969/. Был обнаружен и безмагниевый продукт со смещенным максимумом Соре /inada, Shibata, I960/. Джонс /jones, 1963/, ингибируя биосинтез бактериального хлорофилла в клетках бактерии Rhodopseudomonas spheroides выделил два протохлорофиллоподобных комплекса, которые детально исследовал. Автор показал, что один из них представлен М&-5,4г-дивинил феопорфирином а5, который, по-видимому, является интермедиатом в системе биосинтеза хлорофилла и бактериального хлорофилла. Второй компонент соответствует его безмагниевому производному,.
Б появившихся в последнее время работах содержатся более определенные высказывания в пользу того, что дивиниль-ный компонент является интермедиатом в биосинтезе хлорофилла /Griffiths, Jones, 1975; Belanger, Rebeiz, 1979; 1980 Rebeiz et al., 1980; Duggan, Rebeiz, 1982/,
Работы многих авторов /Кособуцкая, Красновский, 1954; Jones, 1966; Lascelles, Altshuber, 1967; Судьина, Голод, 1970; Голод, Семичаевский,1971; Судьина и др., 1972; Boddi et al., 1979 и др.,/ выявили также большое разнообразие пигментных комплексов in vivo у внутренних оболочек семян тыквенных и сходство с соответствующими комплексами бактериального протохлорофиллового пигмента и протохлорофиллид-го-лохрома этиолированных листьев высших растений.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования были взяты растения, принадлежащие различным Систематическим Группам: ЯЧМеНЬ - Hordeum sativum, , ЛЄН - Linum usitatissimum , огурец - Cucumis sativus, ТЫКВа - Cucurbita maxima , кабачки - Cucurbita pepo , СВвКЛа -Beta vulgaris , липа - Tilia cordata.
Для получения этиолированного материала растения ячменя, льна и огурца выращивали из семян на увлажненной вате в темной камере при комнатной температуре до определенного возраста. Этиолированные листья свеклы получали из корнеплодов, выращивали их также в полной темноте в сосудах с разбавленной питательной средой Кнопа.
Для получения этиолированных листьев липы в одних случаях молодые побеги в конце марта или в начале апреля срезали и помещали в сосуды с разбавленной вдвое питательной смесью Кнопа в темную камеру, в которой в течение 8-Ю дней почки разворачивались. В других случаях использовали этиолированные листья, полученные в результате затемнения отдельных веток на дереве до набухания почек. Ветки закрывали плотным черным бумажным пакетом и сверху черным молескиновым мешочком. В этом случае развертывание почек происходило медленней, но листья оказывались больше по размеру и с хорошим тургором. По мере надобности, ветки, начиная с середины мая, срезали и помещали в темноту в сосуд с водой и этиолированные листья использовались для проведения опытов.
В определенных случаях было необходимо получить этиолированный материал с искусственно созданным преобладанием коротковолновой формы протохлорофиллового пигмента. С этой целью дневные листья ячменя нагревали в условиях полной темноты в воде при температуре 46С в течение 5 минут, В случае необходимости нагревание проводили при температуре 70С, при которой происходила полная дезактивация формы 650.
Преобладание коротковолновой формы также получали при подкормке этиолированного ячменя -аминолевулиновой кислотой (АПК) определенной концентрации. При этом использовали фрагменты листьев длиной 2-2,5 см, срезанные из верхней части этиолированных проростков, которые помещали нижними концами в раствор АПК. Растения выдерживали в растворе разное время для получения определенного соотношения длинноволновой и коротковолновой форм.
Формирование фонда молекул
Динамика накопления фонда протохлорофиллового пигмента ко времени наших исследований была в значительной мере изучена. Однако в связи с предпринятым нами изучением последовательности появления спектральных форм пигмента и установленным изменением их соотношения в процессе развития растений в темноте необходимо было сопоставить найденные спектральные характеристики на определенной стадии развития с данными по количественному составу фонда молекул пигмента. Кроме того, для указанного исследования нами использовано ряд объектов, для которых сведения о количественном содержании пигментного фонда в процессе их развития в литературе отсутствовали.
В качестве объектов исследования служили этиолированные растения ячменя, льна и огурца разного возраста (1,5-2 дня от увлажнения семян до гибели растений). Прежде чем перейти к непосредственному определению количества протохлорофиллового пигмента в процессе развития растений в расчете на сырой и сухой вес следовало выяснить, как при этом изменяется содержание сухого вещества.
Представленное на рис. I содержание сухого вещества для растений ячменя, льна и огурца в зависимости от возраста показало, что оно, как и следовало ожидать, незначительно уменьшается у однодольных (ячмень,кривая І), а у двудольных (лен, огурец, кривые 2 и 3 соответственно) происходит значительное уменьшение сухого веса приблизительно до 6-дневного возраста.
class3 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСК0Е СОСТОЯНИЕ ПР0ТОХЛОР0ФИЛЛ0ВОГ0
ПИГМЕНТА ЭТИОЛИРОВАННЫХ ЛИСТЬЕВ class3
С разным соотношением спектральных форм
Анализ литературных данных, приведенных в литературном обзоре, показал, что к началу наших исследований метод иввлекае-мости пигментов полярным и неполярным растворителями широко использовался и оказался результативным при исследовании состояния хлорофиллового пигмента /Сапожников, Черноморский, I960; Шлык, 1965; Шлык, Михайлова, 1972; Шлык и др., 1977/ и почти не применялся для исследования состояния предшественника. Существующие работы /Судьина, Голод, 1970; Голод, Семичаевский, 1971; Судьина и др., 1972/ показали, что метод помогает выявить разницу в физико-химическом состоянии также и для протохлорофиллового пигмента, причем в сравнительно однородном фонде его, поскольку, известно, что пигмент в оболочках семян тыквенных практически целиком этерифицирован.
В связи с изложенным нам представлялось целесообразным применить этот метод для исследования протохлорофиллового пигмента этиолированных растений с различным соотношением спектральных форм, а также в зависимости от возраста и ,кроме того, хлорофиллового пигмента, возникающего из него при освещении и проявляющего гетерогенность в относительном содержании спектральных форм.
В качестве объекта исследования были взяты растения, обладающие как естественным, так и искусственно созданным различным соотношением спектральных форм протохлорофиллового пигмента: ячмень с "нормальным" обычно наблюдаемым соотношением спектральных форм протохлорофиллового пигмента равным около 1,5, характерным для зрелых этиолированных растений; ячмень с искусственно созданным термической обработкой при 46С в течение 5 мин низким соотношением форм (протохлорофиллид 650/про-тохлорофилл 635 равно 0,5-0,6) и липа, у которой наблюдается естественное преобладание коротковолновой формы с максимумом поглощения при 635 нм. В качестве растворителя служила смесь петролейного эфира (темп. кип. 40-70С) с ацетоном разного соотношения (I,2,3,7,10,16 и 20$). Экстракцию пигментов для каждой смеси растворителя проводили из разных проб свежего этиолированного материала. Извлечение чистым ацетоном также проводили на отдельной пробе.
В условиях доминирования длинноволновой формы протохлорофиллового пигмента
Известно, что формирование протохлорофиллида, образование его длинноволновой формы в известной степени коррелирует с формированием структуры проламеллярного тела этиопластов /кіеіп, Schiff, 1972/, которое концентрирует в себе прото-хлорофилловый пигмент /Kahn, 1968/, На очень ранней стадии развития (до 2-3 дней), когда пигмент содержится в виде коротковолновой формы не наблюдается сформированного пролямел-лярного тела. Этиопласты содержат лишь отдельные короткие тилакоиды. Благодаря многочисленным работам установлено, что при освещении этиолированных растений либо изолированных из них этиопластов со сформированной кристаллической решеткой проламеллярного тела светом интенсивности, достаточной для реакции восстановления протохлорофиллида в хлорофиллид, высокая упорядоченность конфигурации проламеллярного тела нарушается и она приобретает вид собранных вместе обособленных везикул. При дальнейшем освещении из указанных везикул постепенно возникает ряд перфорированных ламелл, которые размещаются по строме этиопласта и служат основой для формирования нормальной ламеллярной системы. Этот процесс, вероятно, требует большей световой энергии, чем это необходимо для фотовосстановления протохлорофиллида /Ланг и др., 1971/.
В качестве объекта исследования были взяты этиолированные листья ячменя 8-дневного возраста, у которых, как известно, соотношение длинноволновых и коротковолновых спектральных форм протохлорофиллового пигмента составляет 1,5. Фиксацию растительного материала и приготовление ультратонких срезов проводили по общепринятой методике (глава П).
Как свидетельствуют электронномикроскопические снимки, пластиды интактного ячменя имеют уплотненную структуру про-ламеллярного тела, мембраны которого строго организованы в паракристаллическую решетку (рис.31). Соответственно после освещения одной вспышкой света структура проламеллярного тела нарушается (рис.32 ). Образовавшиеся после фотовосстановления протохлорофиллида везикулы, возникающие при его разрушении, не успевают разойтись и локализуются в области проламеллярного тела. При инкубации освещенных растений в темноте в течение 10 мин изменение структуры проламеллярного тела не наблюдается. При последующем выдерживании растений в темноте 30 мин происходит частичная регенарация проламеллярного тела (рис.32 )» которая коррелирует с регенерацией протохлорофиллида.
