Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ б
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Церулоплазмин и трансферрин - металлопротеиды
плазмы крови 13
-
Структура и функции церулоплазмина ... 13
-
Биосинтез церулоплазмина . . 19
-
Строение трансферрина . 23
-
Биологическая роль трансферрина ...... 27
-
Биосинтез трансферрина ..... 29
Глава 2. Биосинтез, внутриклеточный транспорт и
процессинг секреторных белков ....... 35
-
Топография синтеза секреторных белков ... 35
-
Транспорт белков через мембраны 42
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. материалы и методы
ЗЛ. Выделение полирибосом из печени крысы .... 60
-
Ввделение суммарной юлирибосомной РНК из печени крысы 60
-
Выделение суммарной высокомолекулярной РНК
из цитоплазмы печени крысы ......... 62
-
Получение фракций РНК, обогащенных последовательностями мРНК церулоплазмина и . трансферрина 63
-
Выделение поли(А)-содержащей РНК ...... 63
-
Получение экстракта из зародышей пшеницы . . 64
-
Трансляция РНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы 65
3.8.1. Получение лизата ретикуловдтов кролика ... 66
стр.
3»8i2. Обработка лизата ре тикулоцитов. кролика
микрококковой нуклеазой 66
3.9. Трансляция.РЭД в лизате ретикулоцитов
кролика . 67
-
Выделение клеточного сока из печени крысы 68
-
Трансляция полирибосом из печени крысы в реконструированной, системе.полирибосомы + клеточный сок 68
-
Иммунопреципитация продуктов трансляции 69
-
Электрофорез радиоактивных белков .... 69
-
Электрофорез в трубках 69
-
Электрофорез в пластинчатом полиакриламидном геле 70
3.14. Радиоавтография и флюография.полиакриламидных
гелей 71
-
Выделение микросом 71
-
Выделение фракции аппарата Гольджи 72
Глава 4. Общая характеристика беоклеточных систем трансляции
4.1. Характеристика системы синтеза белка из
зародышей пшеницы 74
4*2* Характеристика реконструированной системы
полирибосомы + клеточный сок.из печени
крысы 86
4.3. Характеристика лизата из ретикулоцитов
кролика как бесклеточной системы трансляции
мРНК 91
Глава 5. Биосинтез церулоплазмина в бесклеточных системах
5.1. Биосинтез церулоплазмина в бесклеточной
системе из зародышей пшеницы 98
стр.
-
Биосинтез церулоплазмина в реконструированной системе полирибосомы + клеточный сок . . . 109
-
Биосинтез церулоплазмина в лизате из ретикулоцитов кролика ... 114
Глава 6. Биосинтез трансферрина в бесклеточных
системах .
6.1. Биосинтез трансферрина в бесклеточной
системе из зародышей пшеницы 125
-
Биосинтез трансферрина в реконструированной системе полирибосомы +КЛЄТОЧННЙ сок .... 131
-
Биосинтез трансферрина в лизате ретикулоцитов кролика ....... 135
Глава 7. Биосинтез и посттрансляционное созревание
трансферрина в субклеточных фракциях
печени крысы . . 138
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 146
ВЫВОДЫ .............. 158
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 160
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (Тф) являются металлопро-теидами плазмы крови, которые синтезируются в печени позвоночных животных. ЦП - это основной медьпротеид плазмы, обладающий специфической оксидазной активностью и медьтранспортной функцией. В частности, ЦП служит донором меди для внутриклеточных медьсодержащих ферментов - цитохромоксидазы, супероксиддисмутазы и др. Тф - это белок, транспортирующий железо и обеспечивающий перенос железа на гемоглобин в кроветворных клетках, а также -на другие гемопротеиды - миоглобин, цитохромные компоненты дыхательной цепи, каталазу.
ЦП и Тф связаны между собой функционально, т.к. ЦП обладает ферроксидазной активностью и окисляет ионы ре2+" в Fe-**" , т.е. способствует образованию ионов ?е3+, которые связываются с алотрансферрином. В структурном отношении ЦП и Тф являются гликопротеидами, молекулы которых состоят из единственных полипептидных цепей, но характеризуются наличием участков внутренней гомологии (доменов). По-видимому, для этих двух белков характерны сходные пути эволюции, включающие стадии дупликации и трипликации предкових генов (III). Более того, в литературе имеются указания на возможное общее эволюционное происхождение этих двух металлопротеидов, основанные на обнаружении структурной гомологии аминокислотных последовательностей ЦП и Тф в функционально существенных участках, в частности, в местах связывания ионов металлов (Со. - для ЦП и Ре - для Тф) /III/.
Интерес к изучению механизмов синтеза и созревания ЦП и Тф обусловлен в значительной степени тем обстоятельством, что недо- - 7 -статочность этих белков является ведущим фенотипическим проявлением некоторых тяжелых наследственных заболеваний человека. Так, недостаточность Тф (снижение концентрации Тф в кровотоке и нарушение способности Тф к связыванию железа) характерна для гемо-хроматоза /116/. Описаны также довольно редкие формы атранс-ферринемии, т.е. полного отсутствия Тф в кровотоке /135/. Недостаточность синтеза ЦП - это ведущий биохимический признак тяжелого наследственного заболевания с аутосомно-рецессивным типом наследования - гепатолентикулярной дегенерации, или болезни Вильсона-Коновалова /2,12,14,18,54,122,137/. Изучение молекулярных механизмов нарушений синтеза ЦП при этой мутации, проведенное в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР, показало, что в печени гомозиготных больных резко снижены как стационарная концентрация ЦП-мРЩ, так и эффективность ее трансляции /14,54,137/. Кроме того, при болезни Вильсона-Коновалова имеет место нарушение посттрансляционного созревания ЦП в печени и секреция в циркуляцию незрелых и функционально неактивных форм ЦП /14/. В то же время в литературе отсутствует информация о последовательности реакций синтеза и созревания ЦП в нормальных гепатоцитах и лишь отдельные работы /118,147,148/ посвящены изучению синтеза Тф. Поэтому дальнейший прогресс в изучении молекулярных механизмов наследственной недостаточности биосинтеза ЦП и Тф должен быть связан с детальным исследованием путей биосинтеза и посттрансляционной модификации этих белков в нормальном организме.
Один из широко используемых подходов к изучению синтеза и созревания секреторных белков - это анализ этих процессов в опытах на реконструированных бесклеточных системах, транслирую- - 8 -щих соответствующие мРНК. Этот подход дает возможность оценки относительного содержания индивидуальных мРНК в гетерогенных препаратах РНК, идентификации первичных продуктов трансляции и воспроизведения реакций ко- и посттрансляционной модификации и трансмембранного переноса белков на реконструированных бесклеточных системах. В литературе нет сведений об изучении бесклеточной трансляции ЦП«*!РНК и имеется лишь одна работа, в которой был исследован бесклеточный синтез Тф крысы /147/,
В то же время создание оптимальных бесклеточных систем для синтеза ЦП и Тф и изучение реакций созревания ЦП и Тф в этих системах является необходимым этапом в общей программе исследований, посвященных анализу экспрессии генов ЦП и Тф в нормальном организме и при наследственных заболеваниях с недостаточностью этих металлопротеидов. Цели и задачи исследования
Основной целью работы было изучение биосинтеза секреторных металлопротеидов ЦП и Тф в бесклеточных системах, идентификация первичных продуктов трансляции мРНК, кодирующих ЦП и Тф, изучение начальных (сопряженных с трансляцией) стадий созревания этих белков.
В конкретные задачи работы входило:
Получить и охарактеризовать три бесклеточные белоксинтезиру-ющие системы - экстракт зародышей пшеницы, лизат ретикулоци-тов кролика и реконструированную систему, содержащую полирибосомы и клеточный сок из печени крысы.
Установить оптимальные условия трансляции Тф-мРНК и ЦП-мРНК в этих бесклеточных системах.
Охарактеризовать первичные продукты трансляции ЦП-мРНК и - 9 -Тф~мРНК в трех белоксинтезирующих системах.
Изучить реакции котрансляционного созревания биосинтетических предшественников ЦП и Тф в бесклеточных системах, запрограммированных соответствующими мРНК.
В опытах с импульсной меткой in vivo изучить динамику появления новообразованного Тф в субклеточных фракциях печени крысы и охарактеризовать изменения молекулярной массы Тф, связанные с его внутриклеточным транспортом.
Научная новизна работы
В работе впервые созданы оптимальные условия для изучения трансляции мРНК церулоплазмина и трансферрина в трех бесклеточных белоксинтезирующих системах. Доля новообразованных ЦП и Тф соответственно равна 1-4$ и 2-6$ суммарного продукта бесклеточной трансляции нефракционированной мРШ печени, В экстракте зародышей пшеницы ЦПчяРНК наиболее эффективно транслируется в среде с высокой ионной силой (186мМ К+), а трансляция Тф-мРНК в меньшей степени зависит от ионной силы среды инкубации.
Впервые показано, что ЦП синтезируется в форме предшественника ( ~ 122 кД), который характеризуется очень высокой чувствительностью к действию протеаз. Начальной стадией котрансляционного созревания ЦП в бесклеточной системе является протеолитическое отщепление Шр-концевой сигнальной последовательности (^4 кД), а затем следует инициация гликозилирования растущих цепей ЦП, связанных с полисомами.
Тф крысы синтезируется в бесклеточных системах в виде предшественника с избыточной последовательностью аминокислот (4 кД), из которых 2 кД приходится на ш2нконцевой сигнальный пептид. Созревание Тф в субклеточных фракциях печени крысы но- - 10 -сит многоступенчатый характер с разнонаправленными изменениями молекулярной массы. Научно-практическое значение полученных результатов
Полученные в работе данные о последовательности парциальных реакций созревания ЦП и Тф и их связи с синтезом этих белков имеют существенное значение для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе нарушений синтеза и процессинга ЦП и Тф при наследственных заболеваниях (гепатолентикулярная дегенерация, атрансферринемия, гемохроматоз). В работе оптимизированы условия бесклеточной трансляции ЦП- и Тф-мїЩ. Обоснован выбор лизата ретикулоцитов как оптимальной системы для бесклеточного синтеза полноразмерных (или почти полноразмерных) первичных продуктов трансляции ЦП-мРНК, экстракта зародышей пшени-цы - для изучения реакций модификации ^-концов продуктов трансляции и реконструированной системы из печени крысы - для анализа последовательности ранних стадий созревания белков, сопряженных с их синтезом на полирибосомах. Эти результаты представляют существенный интерес для практики работы лабораторий, исследующих биосинтез и созревание ЦП, Тф и других секреторных белков в опытах на бесклеточных системах. Структура диссертации диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы I и II), материалов и методов исследования (глава III), собственных исследований (главы ІУ-УТІ), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 34 рисунками и содержит II таблиц. Список литературы содержит 182 названия работ на русском и иностранных языках. - II -
Положения, которые выносятся на защиту
В работе разработаны оптимальные условия трансляции мРНК церулоплазмина и трансферрина в трех бесклеточных системах. Показано, что в зависимости от условий трансляции доля новообразованных ЦП и Тф варьирует соответственно в пределах 1-4$ и 2-6$ суммарного продукта трансляции мРНК печени крысы.
ЦП синтезируется в бесклеточных системах в форме предшественника с молекулярной массой <*122 кД, обладающего очень высокой чувствительностью к протеазам.
Процессинг ~122 кД-предшественника ЦП начинается с отщепления сигнальной последовательности» которая происходит ко-трансляционно на определенной стадии элонгации полипептидной цепи ЦП. Следующая котрансляционная реакция созревания ЦП - это начальное гликозилирование незавершенных цепей, связанных с полисомами.
Тф синтезируется в бесклеточных системах в форме предшественника с молекулярной массой 82 кД, содержащего ин^-концевую сигнальную последовательность ( "-2 кД) и про-после-довательность ( ^ 2 кД) Созревание Тф в субклеточных фракциях печени крысы носит многоступенчатый характер и сопровождается разнонаправленными изменениями его молекулярной массы.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на научной конференции Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР 15 ноября 1983 года. Основные результаты работы доложены на Советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Цщино-на-Оке, 1980 г.) и на Всесоюзном совещании по программе - 12 -"Ген" (Москва, АМН СССР, 1983 г.). - ІЗ -
