Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Структура и свойства Д-глицеральдегид-3-фосфатде- гидрогеназы 9
1.1. Строение молекулы ГАФД 9
1.2. Структура активного центра ГАФД 12
1.3. Кооперативные свойства ГАФД 15
1.4. "Полуцентровые" свойства ГАФД 16
1.5. Модели, объясняющие строение ГАФД 18
1.6. Значение димер-димерной организации ГАФД в процессе катализа 25
2. Применение конформационных зондов 30
2.1. Значение конформационных проб для исследования ферментов "'.""." '. ".' 30
2.2. Применение флуоресцентных зондов для исследования ферментов . 31
2.3. Природа флуоресцентных зондов 37
2.4. Участки белков, связывающие зонды 38
2.5. Поляриметрические методы в исследованиях, связанных с применением конформационных зондов . 39
2.6. Флуоресцентные свойства аурамина 0 43
2.7. Аурамин 0 как конформационный зонд 46
2.8. Применение аурамина 0 для исследования алкоголь-дегидрогеназы /АДГ/ из печени 47
2.9. Применение аурамина 0 для исследования алкоголь-дегидрогеназы /АДТ/ из дрожжей 51
2.10.Взаимодействие алкогольдегидрогеназы с другими катионными зондами 52
2.II. Применение производных зтеноцитозина для исследования ГАЩЦ 57
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 59
1. Использованные реактивы 59
2. Определение концентраций и приготовление растворов реактивов . 60
3. Выделение ГАЩЦ из пекарских дрожжей . 61
4. Выделение ГАЩЦ из скелетных мышц кролика . 63
5. Получение апофермента ГАЗЩ из мышц кролика 65
6. Определение концентрации белка в препаратах ГАЩЦ . 65
7. Определение энзиматической активности ГАЩЦ 66
8. Избирательная модификация SH-груіш. активных центров: фермента иодацетатом и иодацетамидом . 66
9. Флуориметрические исследования . 67
10. Титрование белка красителем 69
11. Титрование комплекса ГАЩЦ-аурамин 0 лигандами . 70
12. Спектрофотометрические измерения 70
13. Поляриметрические исследования 70
14. Исследования методом равновесного диализа 71
15. Седиментационный анализ 72
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 73
1. Флуоресценция аурамина 0, связанного с ГАЗЩ 73
2. Влияние рН среды на флуоресценцию связанного аурамина 0 76
3. Влияние ионов на связывание аурамина 0 с ГАФД . 79
4. Флуоримиетрическое титрование препаратов фермента аурамином 0 34
5. Исследование связывания флуоресцентного зонда дегидрогеназой методом равновесного диализа 87.
6. Связывание акридинового оранжевого с ГАЩЦ из пекарских дрожжей . 90
7. Влияние НДЦ на флуоресценцию и связывание аурамина 0 с ГАЩЦ , 97
8. Влияние НДЦН на флуоресценцию и связывание аурамина 0 с ГАЩ 105
9. Исследование связывания аурамина 0 с ГАЩ методом кругового дихроизма 109
10. Взаимодействие с ГАЩЦ никотинамидмононунлеотида III
11. Влияние аденинсодержащих фрагментов. НАД на связывание аурамина 0 с ГАЩЦ и на флуоресцентные характеристики зонда 118
12. Влияние субстрата и его аналогов на связывание аурамина 0 с ГАЩЦ и флуоресцентные характеристики зонда , 126
13. Изучение модифицированного фермента 133
13.1. Модификация фермента ДІНБ 133
13.2. Модификация фермента алкилирующими агентами . 142
14. Влияние аурамина 0 на реакцию, катализируемую ГАЩЦ 146
15. Изучение способности аурамина 0 связываться с субъединицами ГАЩЦ в различных функциональных состояниях 150
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 156
ВЫВОДЫ 161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 163
- Структура и свойства Д-глицеральдегид-3-фосфатде- гидрогеназы
- Выделение ГАЩЦ из пекарских дрожжей
- Флуоресценция аурамина 0, связанного с ГАЗЩ
Введение к работе
Одной из наиболее важных проблем современной энзимологии можно считать выяснение механизмов конформационных перестроек, претерпеваемых ферментами на различных стадиях катализа,а также структурных изменений,лежащих в основе регуляции их активности. Конформационное состояние фермента определяется прежде всего его взаимодействием со специфическими лигандами - участниками реакции,а также различными эффекторами.У ферментов-олигомеров существенную роль в формировании структуры,обеспечивающей определенное функциональное состояние белковой молекулы, играют межсубъединичные взаимодействия.
Особый аспект эта проблема приобретает в том случае,когда олигомеры формируются при ассоциации идентичных субъединиц. В этой ситуации /наиболее распространенной/ выяснение характера конформационных различий между соседними субъединицами и условий^ которых они возникают,непосредственно связано с пониманием функционального смысла существования олигомерной структуры.
Действительно^ настояцее время накоплен уже значительный экспериментальный материал,показывающий,что изолированные субъединицы ряда ферментов-олигомеров /к их числу относятся некоторые пиридиннуклеотидзавиеимые дегидрогеназы и,в частности,гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназа/ полностью способны к проявлению активности.
Шесте с тем,ассоциация таких субъединиц в олигомер создает систему,в которой возникает их конформационная неэквивалентность. Природа этой неэквивалентности /выявляемой чаще всего в кооперативности по связыванию лигандов,а также по неодинаковой реакционной способности функциональных групп/ в большинстве слу- чаев остается неясной. Наиболее трудноразрешимым остается вопрос о том, возникает ли она просто как следствие ассоциации субъединиц, т.е. является предшествующей в апоферменте, или появляется лишь в результате влияния, индуцированного тем или иным воздействием на белок. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена-зу можно считать модельным ферментом, на котором многие из упомянутых вопросов разработаны наиболее детально. Так, для тетра-мерной молекулы этого фермента, изолированного из разных источников, показано существование выраженной межсубъединичной коопе-ративности. Вопрос о том, существует ли конформационная неэквивалентность субъединиц в апоферменте, остается неясным.
Имеющиеся в настоящее время результаты рентгеноструктурных исследований холофермента разноречивы. То же можно сказать и в отношении пока еще немногочисленных данных, касающихся структуры апофермента. Трактовка кристаллографических данных затрудняется также тем обстоятельством, что конформация белка в кристалле и в растворе может быть несколько различна. Вполне очевидной в связи с этим представляется необходимость дополнения результатов рентгеноструктурного анализа исследованиями белка в растворе.
Среди методических подходов, позволяющих обнаружить тонкие различия конформации белка, часто не выявляемые другими методами, важное место занимает применение флуоресцентных зондов. Характер получаемой с их помощью информации прежде всего зависит от локализации зондов по отношению к участкам молекулы фермента, вовлеченным в конформационные перестройки. Если мы ставим перед собой задачу уловить структурные сдвиги, индуцируемые связыванием лигандов в активном центре или их каталитическим превращением, мы должны использовать зонд, присоединяющийся к ферменту вне области активного центра.
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа относится к числу ферментов, использующих субстраты анионного характера. Ранее было показано, что флуоресцентный зонд анионной природы - 1-анилино-8-нафталиясульфонат также связывается в области активного центра этого белка. С другой стороны, производные этеноцитозина, несущие положительный заряд, присоединялись в участках, отличных от активного центра этого фермента.
В настоящей работе мы установили, что способность связывать зонды катионной природы вне области активного центра можно считать общей закономерностью, отражающей структурные особенности молекулы данной НАД-зависимой дегидрогеназы. Подробное исследование взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с ау-рамином 0 показало, что этот зонд служит чувствительным индикатором конформационных изменений, индуцируемых связыванием лиган-дов в различных областях активного центра фермента, изолированного как из пекарских дрожжей, так и из мышц кролика.
С помощью аурамина 0 удалось выявить конформационную неэквивалентность субъединиц тетрамера и показать, что она предсу-ществует в апоферменте. Использованный нами методический прием впервые позволил идентифицировать в растворе конформацию субъединиц, обладающих высоким сродством к НАД и, следовательно, первыми вступающих в реакцию.
Структура и свойства Д-глицеральдегид-3-фосфатде- гидрогеназы
НАД-зависимые дегидрогеназы имеют олигомерное строение. Алкогольдегидрогеназа /АДГ/ из печени и растворимая малатдегид-рогеназа /МДГ/ являются димерами, в то время как АДГ из дрожжей, лактатдегидрогеназа /ЛДГ/ и Д-глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-наза /ГАФД/ представляют собой тетрамеры.
Межсубъединичные контакты в тетрамерных дегидрогеназах образованы по осям второго порядка, которые в литературе принято обозначать Р, В и 0 /32, 57/. Схематическая модель ГАФД представлена на рис.1. По оси Q в тетрамере ГАФД осуществляются контакты между НАД-связывающими доменами соседних субъединиц /57/. Через эту ось образованы самые прочные контакты в ЛДГ /31/, она также представлена в димерной ЩГ / 32/. Однако, в ГАФД самые прочные межсубъединичные взаимодействия осуществляются через ось Р. При диссоциации на димеры контакты относительно оси Q размыкаются /57/.
Первая попытка сравнительного структурного исследования НАД-зависимых дегидрогеназ была сделана при анализе данных, полученных для ДДТ и АДТ /53/. Уже на уровне низкого разрешения удалось обнаружить структурное сходство в строении отдельных участков этих ферментов.
Выделение ГАЩЦ из пекарских дрожжей
Исследования ГАЩД из дрожжей проводили в буфере, содержащем 0,05 М имидазола, 0,05 A/aCIf 5 мМ ЗДТА при рН 7,9.
ГАЩЦ из мышц кролика исследовали в буфере, содержащем 0,1М КН2Р04, 0,05 М глицина, 5 мМ ЭДТА при рН 8,9.
Концентрации компонентов буфера определяли по навеске.
Приготовление реактивов и определение концентраций производили непосредственно перед опытом.
3. Выделение ГАЩЦ из пекарских дрожжей.
Препарат ГАФД из пекарских дрожжей получили фракционированием белкового раствора сульфатом аммония по методу Кребса /121/.
К двум килограммам измельченныхпреесованных, дрожжей добавляли для плазмолиза 1200 мл толуола, доводили на водяной бане до 45 и, когда содержимое стакана становилось однородным, оставляли при комнатной температуре на 3 часа. Затем доливали 1600 мл бидистиллированной воды, содержащей 5 мМ ЭДТА, и оставляли на ночь в холодной комнате при 4С На следующий день нижний слой отделяли декантацией и центрифугировали 40 минут при 23000 %.Супернатант пропускали через мезгу на воронке Бюхнера и к нему медленно добавляли мелко растертый сухой сульфат аммония из расчета 314 г на I литр белкового раствора, этот процесс проводили на холоду при перемешивании механической мешалкой. Белки, выпавшие в осадок, отделяли центрифугированием при 23000х g в течение 40 минут. К супернатанту снова добавляли сухой сульфат аммония /140 г на I л/ и оставляли на ночь при 4С. На следующий день осадок отделяли центрифугированием при 23000хД в течение 40 минут, растворяли его в бидистилляте, содержащем 5 мм ЭДТА, и по каплям добавляли насыщенный при 4С сульфат аммония /рН 8,2/ до появления легкого помутнения. рН белковог раствора доводили до 8,2 охлажденным насыщенным раствором аммиака и оставляли для кристаллизации на три дня при 4 С .Аналогичным образом проводили перекристаллизацию фермента. Выделение фермента проводили в холодной комнате при температуре 0-4С Кристаллический препарат дегидрогеназы хранили при 0-4С в виде суспензии в 2,4 М сульфате аммония, содержащем 5 мМ ЭДГА при рн 8,2. Непосредственно перед употреблением препарат растворяли в рабочем буфере, содержащем 5 мМ ДТТ, и инкубировали 15 минут для восстановления 5Н-групп, которые могли частично окислиться при хранении белка.
Флуоресценция аурамина 0, связанного с ГАЗЩ
Связывание А с ГАФД из скелетных мышц кролика и пекарских дрожжей впервые обнаружено в нашей работе /15/.
Как видно из- рис.8, связывание А с ГАФД приводит к батохромному сдвигу и гиперхромному эффекту в спектре поглощения . красителя. Аналогичные эффекты возникают при связывании А с АДГ из печени /62/.
Гораздо большие изменения происходят в эмиссионных характеристиках красителя, результаты, приведенные в таблице I,показывают, что квантовый выход флуоресценции А, связанного с белками, на три порядка выше, чем свободного в водной среде. Взаимодействие красителя с ГАФД приводит к значительному увеличению интенсивности флуоресценции связанного А. В условиях наших опытов заметной флуоресценции свободного А в растворе не обнаружено. Спектры флуоресценции и возбуждения красителя, связанного с ГАФД из дрожжей и скелетных мышц кролика, представлены на рис.9. Максимумы спектров флуоресценции расположены при 515 нм. Следует заметить, что приведенные нами спектры не корректирован, на спектральную чувствительность прибора. Значительное увеличение интенсивности флуоресценции связанного А свидетельствует о высокой вязкости микроокружения красителя в участке связывания, так как предыдущие исследования показали, что интенсивность флуоресценции А очень чувствительна к вязкости растворителя и мало зависит от полярности окружения /61, 147/.
