Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение механизмов тканеспецифи-ческой экспрессии генов млекопитающих и оперативной регуляции их активности под действием внешних и внутренних факторов продолжает оставаться одной из центральных проблем молекулярной биологии. Удобной экспериментальной системой для исследования этой проблемы являются гены, индуцируемые гормонами, в частности, стероидными гормонами, которые играют важную роль в дифференцировке клеток и тканей и в реіуляции метаболических процессов в клетках-мишенях.
В настоящее время основное внимание исследователей сосредоточено на выяснении механизмов активации экспрессии генов под действием гормонов, хотя оперативная регуляция активности генов под действием внешних и внутренних факторов (например, стероидных гормонов) должна обязательно включать в себя как механизмы, вызывающие усиление генной активности, так и механизмы, снижающие активность генов в деиндукционный период, к сожалению, эта вторая сторона вопроса, несмотря на ее очевидную важность, практически не исследовалась, что явилось одной из основных задач данной работы.
Одним из широкоизвестных генов,регулируемых гормонами у млекопитающих, является ген тирозинаминотрансферазы (ТАТ, 1 - тирозин; 2 - оксоглутаратаминотрансфераза, К 2.6.1.5).
Нужно отметить, что все основные исследования регуляции экспрессии гена ТАТ выполнены на перевиваемых культурах клеток, что позволяет исследовать реакцию генетических однородных клеток и упрощает ряд экспериментальных процедур, например, трансфекцию экзогенного генетического материала. Однако, очевидно, что характер ответа у перевиваемых клеточных линий может существенно отличаться от результатов, получен-
ных на экспериментальных животных, в силу генетических различия клеток-мишеней и возможного участия ансамблей разных клеток в формировании ответа на гормон-индуктор, в связи с этим и, учитывая важность понимания механизмов действия гормонов для медицины, представляется необходимым исследовать молекулярные механизмы регуляции генной активности наряду с использованием культур клеток непосредственно на экспериментальных животных. Кроме того, анализ экспрессии генов на лабораторных животных является принципиальным и для изучения тканевой специфичности их активности.
Цель к задачи исследования. Целью работы явилось изучение экспрессии гена ТАТ в печени крыс в норме и при введении гормона - индуктора гидрокортизона для выяснения закономерностей и механизмов индукционного и деиндукционного процессов, а также сравнительный анализ экспрессии этого гена в разных тканях крысы. Исследование предусматривало постановку и решение следующих задач.
-
Детальный анализ динамики активности ТАТ и содержания мрнк ТАТ в печени крыс после введения гидрокортизона в ивдукциошшй и деиндукционный периоды.
-
Изучение влияния гидрокортизона на скорость транскрипции гена ТАТ в печени крыс.
-
Исследование причин, обеспечивающих снижение активности гена ТАТ в печени крыс в деиндукционный период после введения гидрокортизона.
-
Анализ экспрессии гена ТАТ в разных тканях по уровню ферментативной активности и содержанию специфической мрнк.
-
Анализ влияния гидрокортизона на экспрессию гена ТАТ в разных тканях крысы.
Научная новизна, в работе впервые детально изучена динамика содержания мРНК ТАТ в печени крыс после однократного введения гормона-индуктора гидрокортизона, установлено, что транзиетный характер индукции гидрокортизоном активности ТАТ обусловлен транзяетным характером изменения содержания МРНК ТАТ. '
Установлено, что введение гидрокортизона крысам приводит к существенному увеличению скорости транскрипции гена ТАТ в печени, что, вероятно, является основной причиной увеличения уровня мРНК ТАТ в этой ткани в индукционный период.
Обнаружено, что ингибитор трансляции циклогексимид увеличивает содержание мРНК ТАТ в печени крыс, активизируя транскрипцию гена ТАТ.
Обнаружено, что ген ТАТ, помимо печени крыс, экспресси-руется и в других тканях (почка, мозг, сердце). При этом уровень активности ТАТ пропорционален содержанию мРНК в исследованных тканях.
Установлено, что в почках, мозге и сердце крыс активность ТАТ и содержание мРНК не изменяется при введении гидрокортизона. Сделано заключение, что тканеспецифических характер экспрессии и гормональной регуляции гена ТАТ У крыс определяется претрансляционными процессами, вероятно, тканеспе-цифическим характером транскрипции гена ТАТ.
Теоретическое и практическое значение работы. Совокупность представленных результатов может способствовать более глубокому пониманию молекулярных механизмов регуляции активности генов гормонами.
Исследованная, в данной работе феноменология тканевой специфичности индукции тярозянашнотрэнсферазы может послу-
жить основой для выяснения тонких молекулярных механизмов тканевой специфичности генной экспрессии, выявленные закономерности процесса деиндукции могут лечь в основу рекомендаций при назначении схем введения стероидных препаратов в клинике.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на всесоюзной конференгдии "Молекулярная биология генов высших организмов" (Москва, 1987), на рабочем Совещании "регуляция экспрессии генов млекопитающих" (Новосибирск, 1989), на П международном симпозиуме "Молекулярная гинетика сахарного диабета" (Грейфсвальд, ГДР, 1990).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения. л выводов, работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 272 источника.