Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

"Изучение механизма активации каспазы-2 при генотоксическом стрессе" Замараев Алексей Владимирович

Диссертация - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Замараев Алексей Владимирович. "Изучение механизма активации каспазы-2 при генотоксическом стрессе": диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.01.04 / Замараев Алексей Владимирович;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2017.- 139 с.

Введение к работе

Актуальность исследования

Одной из задач современной медицины является борьба с онкологическими
заболеваниями. Установлено, что нарушение процесса удаления поврежденных
клеток, их неконтролируемое деление, а также приобретенное свойство
устойчивости к химиотерапевтическому воздействию являются причинами
развития опухолей. Программируемая клеточная гибель, апоптоз, является
неотъемлемым процессом, свойственным всем многоклеточным организмам,
играющим центральную роль в дифференцировке клеток, удалении

поврежденных клеток и гомеостазе иммунной системы.

Основными ферментами, участвующими в инициации процесса апоптоза и его дальнейшем протекании, являются белки семейства цистеиновых протеаз -каспазы. В клетке каспазы существуют в виде проформы, для активации которой необходимо ее протеолитическое расщепление c образованием активного гетеротетрамера. Процесс активации инициаторных каспаз (-2, -8, -9, -10), ответственных за запуск апоптотической гибели, происходит в составе высокомолекулярных комплексов. Эти комплексы формируются в клетке в ответ на внешние или внутренние стимулы. Поскольку каспазный каскад является ключевым событием апоптоза, то выявление его неизвестных участников и механизмов активации дает возможность получить сведения о процессе гибели клеток и понять принципы возникновения заболеваний, связанных с нарушениями апоптотического процесса, в том числе онкологических.

В 2004 г было установлено, что одна из инициаторных каспаз, каспаза-2, активируется в составе комплекса PIDDosome, состоящего из белков PIDD, RAIDD и каспазы-2 (Tinel A, Tschopp J, 2004). Однако позже было показано, что удаление белка PIDD не влияет на способность каспазы-2 активироваться в ответ на повреждение ДНК (Vakifahmetoglu H. et al., 2006). Эксперименты с PIDD-нокаутными мышами подтвердили это наблюдение (Manzl C., et al., 2009). Было высказано предположение, что каспаза-2 может быть активирована в ответ на повреждения ДНК в составе комплекса, неописанного в литературе.

В представляемой работе показано, что обработка клеток карциномы яичника
ДНК-повреждающим препаратом цисплатином приводила к формированию
высокомолекулярной платформы, в состав которой входила процессированная и
активированная каспаза-2. В ходе работы было установлено, что обработка клеток
карциномы яичника цисплатином приводит к индукции не только апоптоза, но и к
некроптотической смерти. Некроптоз – недавно открытый и интенсивно
исследуемый тип программируемой гибели, запускаемый клеточными

рецепторами или механизмами, узнающими цитоплазматические вирусные РНК. В процессе некроптоза происходит сборка внутриклеточного комплекса, некросомы, в составе которого происходит ряд пост-трансляционных модификаций белков RIP1, RIP3 и MLKL, приводящих к разрыву клеточной мембраны и ведущих к воспалительному процессу. Механизмы некроптоза и его связь с гибелью опухолевых клеток остается слабо изученными. Нами впервые показана роль каспазы-2 как отрицательного регулятора некроптотической гибели клеток, а также продемонстрирован возможный механизм воздействия каспазы-2 на ключевые компоненты некроптотического пути.

Данные исследования помогут не только установить механизмы контроля некроптотической и апоптотической гибели, но и предсказать эффективность воздействия химиотерапевтических агентов. Разработка подходов для выделения макромолекулярного комплекса каспазы-2 и дальнейший протеомный анализ способны раскрыть фундаментальные механизмы запуска апоптоза и важны для создания новой стратегии терапии онкологических заболеваний.

Цель исследования

Цель данной работы состоит в изучении механизма активации каспазы-2 при генотоксическом стрессе и ее роли как переключателя между апоптотическим и некроптотическим типами гибели клеток.

Задачи исследования

1. Проанализировать образование высокомолекулярного комплекса, в состав которого входит каспаза-2, при генотоксическом стрессе и определить ферментативную активность каспазы-2 в составе данного комплекса.

  1. Выявить присутствие белковых компонентов PIDDosome в составе высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2.

  2. Создать методику выделения данного комплекса из клеток карциномы яичника человека и провести его масс-спектрометрический анализ.

  3. Изучить влияние каспазы-2 на некроптотическую гибель клеток карциномы яичника при генотоксическом стрессе, и оценить воздействие каспазы-2 на ключевые компоненты некроптотического пути.

  4. Изучить пост-трансляционные модификации каспазы-2 методом сравнительного анализа как первичной, так и третичной структуры белка.

Научная новизна

Проведенное в настоящей работе исследование функций каспазы-2 в
апоптотической и некроптотической гибели клеток в ответ на повреждение ДНК
позволило получить принципиально новые научные знания о процессах ПГК. В
ходе работы было показано, что при генотоксическом стрессе в клетках
карциномы яичника формируется ранее не описанный в литературе
высокомолекулярный комплекс, содержащий каспазу-2. Для идентификации
компонентов данного комплекса был разработан метод выделения

высокомолекулярных платформ из лизата клеток карциномы яичника. В процессе биоинформатического анализа были выявлены новые потенциальные сайты фосфорилирования каспазы-2, которые могут принимать участие в регуляции активности фермента.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют глубже понять фундаментальные
процессы ПГК, протекающие в раковых клетках при обработке

химиотерапевтическим ДНК-повреждающим агентом. Помимо этого,

полученные знания помогут оценить успешность применения тех или иных химиотерапевтических агентов при терапии злокачественных новообразований, а также в будущем повысить эффективность лечения.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационной работы были внедрены в научно-

исследовательскую и образовательную деятельность на факультете

фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова, в частности в циклы лекций «Программируемая гибель клеток в медицине» и «Токсикология». В ходе работы был разработан способ выделения белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 человека, на основании которого была подана заявка на патент (№2016126059).

Апробация результатов исследования

Основные материалы работы были представлены на XXI Международной Европейской конференции по апоптозу «Cell Death: a Biomedical paradigm» (Париж, Франция, 26 сентября 2013 г.); XXII Международной Европейской конференции по апоптозу «Cell Death & Rejuvenation» (Xерсониссос, Греция, 2 октября 2014 г.).

Апробация работы была проведена на совместном заседании кафедры
биохимии и молекулярной медицины, кафедры медицинской биофизики,
лаборатории исследований механизмов апоптоза факультета фундаментальной
медицины МГУ имени М.В.Ломоносова, лаборатории молекулярных

механизмов гемостаза ФГБУН ЦТП ФХФ РАН и сотрудников факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, протокол №1, 9 июня 2017 г.

Публикации

По теме исследования за период с 2013 по 2017 опубликовано 8 работ, из них - 3 статьи в рецензируемых отечественных журналах и 3 статьи в международных журналах, 2 тезисa в сборниках научных работ на международной конференции «ECDO Euroconference on Apoptosis».

Объм и структура работы

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и
состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и
методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы,

благодарности. Список литературы содержит 205 источников. Диссертация иллюстрирована 38 рисунками и 3 таблицами.

Индукция клеток. В экспериментах использовали клетки карциномы яичника Caov-4 и клетки с пониженным содержанием каспазы-2 – Caov4-мшРНК-каспаза-2. Гибель клеток вызывали цисплатином (ТЕВА) (70 мкМ). Некроптоз вызывали пан-каспазным ингибитором zVAD-fmk (Bachem) (50 мкМ) в сочетании с цисплатином. Для блокирования некроптотической гибели использовался ингибитор белка RIP1 - некростатин-3 (10 мкМ).

Трансфекция клеток. Трансфекция клеток Caov-4-мшРНК-каспаза-2

проводилась по стандартному протоколу с использованием трансфицирующего агента липофектамина LTX (Thermo Fisher Scientific).

Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) и Вестерн-блот.

Образцы после добавления Лэммли буфера были нагреты до 95оС, разделены в 12% ПААГ геле (Bio-Rad) и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad), которая была блокирована в растворе обезжиренного молока, отмыта в PBS и проинкубирована с первичными антителами. После промывок раствором PBST, мембрана была проинкубирована с вторичными антителами, промыта и проявлена с помощью ECL (Promega) на приборе ChemiDoс XRS (Bio-Rad).

FAСS-анализ. Клетки инкубировали в присутствии индукторов гибели, снимали
с чашек, центрифугировали и промывали раствором PBS. Клетки (500 тыс.)
ресуспендировали в аннексин-связывающем буфере, добавляли аннексин V- FITC
(Invitrogen) и инкубировали в темном месте. Далее к пробам добавляли пропидий
йодид (BD Biosciences) и анализировали с помощью проточного

цитофлуориметра Guava (Merck Millipore) и Amnis FlowSight (Merck Millipore). Иммунопреципитация. Клетки (2 млн.) снимали с чашек в среде, отмывали в растворе PBS, лизировали и центрифугировали. После чего проводили иммунопреципитацию согласно протоколу (Kopeina et al, 2016).

Масс-спектрометрический анализ. Образцы, полученные после

иммунопреципитации, анализировали на приборе Hybrid dual-pressure linear ion trap/orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Scientific), оснащенном EASY-nLC Ultra HPLC (Thermo Scientific).

Гель-фильтрация. Клетки (2 млн.) снимали с чашек в среде, отмывали в PBS, лизировали и центрифугировали. Гель-фильтрацию полученного лизата проводили на приборе KTA Lab-Scale Systems (GE Healthcare) с носителем Superose 6 (GE Healthcare) согласно протоколу (Kopeina et al, 2016).

Метод миРНК. Трансфекция проводилась по стандартному протоколу с использованием трансфицирующего агента RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) и миРНК против белка RAIDD (Dharmacon) или контрольной миРНК (Dharmacon). Измерение активности каспазы-2. Измерение каспазной активности в лизатах клеток проводили с использованием флуоресцентного субстрата Ac-VDVAD-AMC (PeptaNova) на приборе Varioskan Flash (Thermo Scientific) согласно протоколу, представленному производителем.