Введение к работе
Актуальность
Одной из первых групп мутуалистических бактерий, заселяющих стерильный кишечник доношенных новорожденных после естественных родов, являются бифидобактерии. Род Bifidobacterium относится к классу Actinobacteria и включает в себя грамположительные неспорообразующие облигатно-анаэробные палочки с высоким содержанием пар гуанин-цитозин в геномной ДНК [Ventura и соавт., 2007]. Благотворное влияние бифидобактерии на физиологию желудочно-кишечного тракта и всего организма в целом связывают с их способностью к конкурентному подавлению патогенных и условно-патогенных бактерий, способностью к продукции витаминов и других биологически активных соединений, а также противовоспалительной, антиканцерогенной и иммуномодулирующей активностью [Fukuda и соавт., 2011; Sreekumar и Hosono, 1998; Kohno и соавт., 2009; Ruas-Madiedo и соавт., 2006]. Позитивные свойства бифидобактерии в сочетании с полным отсутствием факторов патогенное объясняют высокий интерес исследователей к данной группе микроорганизмов.
С позиции практической медицины одним из наиболее важных свойств бифидобактерии является их противовоспалительная активность. Известно, что у больных с тяжелыми воспалительными заболеваниями кишечника (болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом) наблюдается резкое снижение титра бифидобактерии и ряда других комменсалов (бактероидов, клостридий групп 1Ха и IV, Faecalibacterium praustnitzii) в фекальной микрофлоре [Mylonaki и соавт., 2005; Fava и соавт., 2011; Sokol и соавт., 2009]. Одновременно с этим была показана способность ряда пробиотических формул, содержащих бифидобактерии, вызывать и поддерживать стойкую ремиссию у пациентов с неспецифическим язвенным колитом, синдромом раздраженного кишечника и резервуарным илеитом [Miele и соавт., 2009; Guandalini и соавт., 2009]. Исследования с использованием животных и клеточных моделей также выявили способность бактерийных препаратов на основе бифидобактерии подавлять развитие воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника, снижать интенсивность симптомов колита, подавлять секрецию провоспалительных цитокинов и стимулировать продукцию противовоспалительных факторов иммунокомпетентными клетками [Mennigen и соавт., 2009; Maslowski и соавт., 2009]. Однако вопрос о механизме этой противовоспалительной активности и роли секретируемых метаболитов и компонентов клеток бифидобактерии в ее проявлении до сих пор остается открытым.
Выяснение молекулярных механизмов противовоспалительного эффекта бифидобактерии расширит наши представления о путях взаимодействия бактерий-комменсалов с организмом хозяина, позволит глубже понять роль микрофлоры в регуляции воспалительных процессов в кишечнике, и приведет к созданию новых лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний кишечника. Однако дальнейшие исследования в этом направлении
невозможны без активного использования современных подходов молекулярной биологии, биохимии, геномики и протеомики. В последние два десятилетия совершен значительный рывок в изучении генетики и молекулярной биологии бифидобактерий: просеквенированы геномы нескольких видов бифидобактерий, созданы генетические векторные системы, совершенствуются методы генетической трансформации бифидобактерий [Schell и соавт., 2002; Lee и соавт., 2008; Shkoporov и соавт., 2008; Suzuki и соавт., 2011].
Адаптация современных методов генетической инженерии к работе с бифидобактериями открывает новый этап в изучении биологии данных микроорганизмов и разработке принципиально нового класса пробиотических препаратов на их основе [Cronin и соавт., 2010]. Одним из перспективных направлений может стать получение штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами за счет продукции ими ряда рекомбинантных белков — противовоспалительных цитокинов, миниантител, растворимых рецепторов. В то же время недостаточно проработанным остается вопрос о подходах к эффективной продукции гетерологачных рекомбинантных белков в бифидобактериях. Требуется проведение дополнительных исследований с целью получения клонирующих векторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии гетерологачных генов и требуемую субклеточную локализацию целевых рекомбинантных белков.
Цель исследования
Изучение механизмов естественной противовоспалительной активности штаммов бифидобактерий, колонизирующих кишечник здоровых людей, и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с искусственно усиленными противовоспалительными свойствами.
Задачи исследования
-
Провести поиск в коллекции бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей раннего возраста, штаммов, обладающих наиболее выраженными противовоспалительными свойствами на модели клеточной линии кишечных эпителиоцитов.
-
Изучить молекулярный механизм реализации противовоспалительных свойств избранных штаммов бифидобактерий: характер действующего начала, его субклеточную локализацию, особенности воздействия на клетки эпителия кишечника.
-
Создать серию клонирующих векторов для бифидобактерий, обеспечивающих оптимальную экспрессию генов рекомбинантных белков с противовоспалительными свойствами (интерлейкин-10 человека, человеческие анти-ФНО а-миниантитела).
-
Изучить биологическую активность полученных штаммов бифидобактерий, продуцирующих рекомбинантные белки с противовоспалительными свойствами, на модели клеточной линии кишечных
эпителиоцитов.
Научная новизна
В ходе настоящего исследования с использованием модели кишечных
эпителиоцитов впервые показано наличие противовоспалительных свойств у
широкого круга штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых
детей. Обнаружено, что свежевыделенные изоляты бифидобактерий обладают
более выраженной противовоспалительной активностью по сравнению со
штаммами, культивированными in vitro в течение длительного времени.
Показано, что противовоспалительная активность штаммов бифидобактерий
различных видов связана с секрецией низкомолекулярных термостабильных
соединений, которые подавляют продукцию провоспалительных цитокинов в
культуре клеток. Впервые изучены особенности транскрипционного ответа
кишечных эпителиоцитов на воздействие бифидобактерий.
Продемонстрировано, что бифидобактерий, не оказывая влияния на базальный
уровень транскрипции, модулируют экспрессию генов ИЛ-8, CCL20, ІкВ^,
р21СІР в условиях стимуляции клеток ЛПС и ФНО-а. Определен примерный
механизм противовоспалительной активности бифидобактерий.
Продемонстрирована способность бифидобактерий к подавлению активности транскрипционного фактора NF-кВ и снижению фосфорилирования его ингибитора — ІкВа.
Впервые проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии рекомбинантного человеческого ИЛ-10 в бифидобактериях с использованием различных регуляторных элементов — промоторов, сайтов инициации трансляции, сигнальных пептидов, заимствованных из нескольких генов бифидобактерий видов В. breve, В. Іопдит, В. adolescentis. Показано, что наивысший уровень экспрессии и корректный процессинг рекомбинантного белка достигается при использовании промотора гена дар В. Іопдит и сигнального пептида белка АтуВ В. adolescentis. С использованием наиболее эффективных регуляторных элементов были созданы клонирующие векторы и получены штаммы бифидобактерий, продуцирующие рекомбинантный ИЛ-10 человека и рекомбинантные человеческие миниантитела к ФНО-а. Противовоспалительная активность данных штаммов была продемонстрирована in vitro на модели воспалительного ответа в клеточной культуре НТ-2Э.
Практическая значимость работы
В ходе данного исследования был проведен скрининг кишечных изолятов бифидобактерий на наличие противовоспалительной активности in vitro, по результатам которого был отобран ряд штаммов, обладающих наиболее выраженными свойствами.
Сконструированные в данной работе клонирующие векторы, обеспечивающие эффективную экспрессию гетерологичных генов в
бифидобактериях, могут быть использованы для создания штаммов, продуцирующих рекомбинантные белки: цитокины, антитела, вакцинные антигены, вещества с антимикробной активностью, ферменты. В ходе исследования получены штаммы бифидобактерий, продуцирующие рекомбинантные белки с противовоспалительной активностью — ИЛ-10 человека и человеческие миниантитела к ФНО-а.
Положения, выносимые на защиту
-
Бифидобактерий, колонизирующие кишечник здоровых детей, обладают противовоспалительной активностью. Эта активность опосредована действием секретируемых термостабильных низкомолекулярных соединений не белковой природы и заключается в дозозависимом подавлении экспрессии генов провоспалительных цитокинов на уровне транскрипции в клетках кишечного эпителия.
-
Воздействие метаболитов бифидобактерий на кишечные эпителиоциты сопровождается подавлением активности сигнального пути NF-кВ, ингибированием фосфорилирования ІкВа и модуляцией экспрессии ряда генов, вовлеченных в процессы воспаления, хемотаксиса и регуляции клеточного цикла.
-
Созданные в ходе настоящего исследования клонирующие векторы позволяют получать штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие рекомбинантный интерлейкин-10 человека и рекомбинантные анти-ФНО-сх миниантитела. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков обладают противовоспалительной активностью в in vitro модели кишечного воспаления.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов, врачей интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития.
Полученные в ходе работы рекомбинантные плазмиды используются на кафедре микробиологии и вирусологии и в лаборатории микробологиии биологической безопасности ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития для проведения фундаментальных и прикладных исследований, посвященных изучению биологии бифидобактерий и созданию штаммов бифидобактерий с заданными свойствами.
Апробация работы
Основные положения работы были доложены на заседании совместной научно-практической конференции кафедр микробиологии, биохимии и медицинских нанобиотехнологий ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Минздравсоцразвития 9 июня 2011, а также на 15-ом международном конгрессе International Congress of Mucosal Immunology (5-9 июля 2011, Париж) и на 34-ом международном конгрессе Congress of Society for Microbial Ecology and Disease (20-23 ноября 2011, Йокогама).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 7 статей в рецензируемых научных журналах (2 в отечественных из списка ВАК, 5 в зарубежных).
Объем и структура работы
Работа изложена на русском языке, на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 350 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и 5 таблицами.
Похожие диссертации на Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами
