Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Роль протеолитических ферментов в функционировании организма 13
1.2. Ферменты семейства неприлизина 14
1.3. Неприлизин. Свойства и функции 16
1.4. Образование амилоидного пептида (АР) 22
1.5. Свойства амилоидного пептида 26
1.5.1. Выведение Ар из организма и мозга 28
1.6. Регуляция экспрессии неприлизина
1.6.1. Регуляция экспрессии неприлизина внутриклеточным фрагментом белка предшественника амилоидного пептида (AICD)
1.6.2. Альтернативные пути регуляция экспрессии неприлизина 32
1.6.3. Активность каспаз при действии патологических факторов 33
1.6.4. Гипоксия, как фактор, влияющий на изменение экспрессии и активности неприлизина
1.7. Мягкое когнитивное снижение и болезнь Альцгеймера 37
1.8. Поиск маркеров для ранней диагностики болезни Альцгеймера
1.9 Заключение 44
2. Материалы и методы 45
2.1. Экспериментальные животные 45
2.2. Модель пренатальной гипоксии 46
2.3. Анализ кратковременной памяти 46
2.4. Оценка кратковременной и долговременной памяти в модифицированном тесте «распознавание новых объектов»
2.5. Введение ингибиторов каспаз в желудочки мозга крыс 47
2.6. Внутрибрюшинные введения крысам вальпроата натрия 48
2.7. Выделение мембраносвязанных фракций белков из структур мозга крыс
2.8. Получение плазмы крови крыс 49
2.9. Культура клеток нейробластомы человека NB7
10. Культивирование клеток нейробластомы человека NB7 в 50 гипоксических условиях
11. Экстракция мРНК 50
12. Количественное определение РНК 50
13. Флуоресцентный метод определения активности неприлизина 50
14. Определения уровня связывания AICD с промотором гена НЕП при помощи метода иммунопреципитации хроматина
15. ПНР в реальном времени 52
16. Определение концентрации белка 53
17. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ 54
18. Анализ белков с использованием иммуноблоттинга 54
19. Анализ экспрессии неприлизина методом иммуноцитохимии и флуоресцентной конфокальной микроскопии
20. Обследование пациентов для постановки диагноза МКС или болезнь Альцгеймера
21. Получение плазмы крови пациентов (R)
22. Применение лекарственного препарата Цераксон 57
23. Статистический анализ результатов 58
Результаты исследования 59
1. Изменение активности и экспрессии неприлизина в ткани мозга крыс в ходе нормального онтогенеза и после пренатальной гипоксии
1.1. Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга интактных крыс
1.2. Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию
1.3. Анализ экспрессии неприлизина в теменной коре мозга молодых и 63 взрослых интактных крыс
1.4. Влияние старения и пренатальной гипоксии на изменение процессов обучения и запоминания у крыс
2. Сравнительный анализ влияния пренатальной гипоксии на изменение активности и экспрессии неприлизина в теменной коре и гиппокампе взрослых крыс
3. Исследование механизмов регуляции неприлизина с использованием клеток нейробластомы человека NB7
3.3.1. Влияние гипоксии на уровень экспрессии и активности неприлизина в культуре клеток NB7
3.3.2. Эффект гипоксии на активность членов семейства каспаз 71
3.3.3. Изменение уровня связывания транскрипционного фактора AICD промотором гена НЕП при гипоксии
3.3.4. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение активности неприлизина при гипоксии
3.3.5. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение уровня связывания AICD с промотором гена НЕП при гипоксии
3.4. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение экспрессии неприлизина и содержание AICD при гипоксии in vivo
3.5. Эпигенетическая регуляция экспрессии неприлизина вальпроатом натрия in vivo
3.6. Влияние антиоксиданта эпигаллокатехин-3-галлата на активность неприлизина в ткани мозга крыс
3.7. Изменение активности неприлизина в плазме крови крыс в норме и после пренатальной гипоксии
3.8. Анализ активности неприлизина в плазме крови пациентов с мягким когнитивным снижением и БА
3.9. Влияние фармакологического агента Цераксона на изменение активности неприлизина и состояния пациентов
4. Обсуждение 95
5. Заключение 100
6. Выводы 102
Перечень сокращений 103
Список литературы 105
- Неприлизин. Свойства и функции
- Оценка кратковременной и долговременной памяти в модифицированном тесте «распознавание новых объектов»
- Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга интактных крыс
- Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение экспрессии неприлизина и содержание AICD при гипоксии in vivo
Неприлизин. Свойства и функции
Ферменты семейства неприлизина (М13) представляют собой большую группу цинк-зависимых металлопептидаз, первой из которых был описан неприлизин млекопитающих (ЕСЗ.4.24.11, нейтральная эндопептидаза, НЕП) (Turner et al, 2004). Ферменты данного семейства участвуют в метаболизме биологически активных пептидов и вовлечены в большое число физиологических процессов в организме млекопитающих. К их числу относятся, например, участие пептидаз в окончании действия пептидэргических сигналов и изменении уровней содержания нейротрансмиттеров, контроль кровяного давления, репродуктивные функции, развитие раковых заболеваний. Большинство описанных пептидаз М13 представляют собой эндопептидазы, расщепляющие амино-концевые связи гидрофобных остатков (Turner et al, 2001). Характерными чертами ферментов данного семейства является их чувствительность к ингибированию фосфорамидоном, а субстраты представляют собой пептиды маленького или среднего размера (в том числе энкефалины, тахикинины, опиоидные пептиды, эндотелины и бомбезин).
Недавно было показано, что несколько членов семейства неприлизина способны расщепляют Ар в мозге млекопитающих и повышение их экспрессии с помощью разных подходов снижает количество Р-амилоидного пептида в ткани мозга (Marr et al, 2003; Hemming et al, 2007; Carty et al, 2013; Park et al, 2013). НЕП является типичным интегральным мембранным белком второго типа, активный центр которого обращен во внеклеточное пространство (Turner et al, 2001). Существует также гомолог неприлизина (НЕП2), который встречается как в мембраносвязанной, так и в растворимой форме в организме млекопитающих (человек - MMEL2, грызуны - SEP/NL1 и НЕП2) и насекомых (Drosophila melanogaster) (Ghaddar et al, 2000; Facchinetti et al, 2003; Thomas et al, 2005; Whyteside and Turner, 2008). Данные ферменты характеризуются выраженной экспрессией в мужских половых гонадах, что позволяет предположить их физиологическую роль в репродукции. Показано, что скрещивание самок мышей дикого типа с самцами, у которых удален ген SEP/NL1, дает малое количество потомства, что свидетельствует о важной роли данного фермента в реализации репродуктивной функции млекопитающих.
Эндотелин-конвертирующий фермент (ЭКФ или ЕСЕ) и группа гомологичных ему ферментов имеют различную биологическую природу. ЭКФ-1 существует в виде 4 изоформ и его физиологическая роль заключается в метаболизме эндотелинов и регуляции кровяного давления, путем образования зрелого эндотелина из его неактивного предшественника большего размера (Ahn and Johnson, 2004). Мыши, лишенные гена ЭКФ-1, имеют летальный фенотип с серьезными нарушениями процессов развития, включая черепно-лицевое формирование (Yanagisawa et al, 2000). ЭКФ-2 экспрессируется в основном в нейронах и считается, что этот фермент вовлечен в процессинг пептидов до их секреции (Ahn, 2004).
Подобный эндотелин-конвертирующему ферменту-1 (ECEL-1, ХСЕ) и его гомолог у грызунов - индуцируемая повреждением нейрональная эндопептидаза (damage-induced neuronal endopeptidase - DINE) также являются характерными представителями семейства М13 (Valdenaire, 2004; Kiryu-Seo et al, 2000). DINE был идентифицирован благодаря увеличению его экспрессии после повреждения нервной ткани и, как было показано, он обладает нейропротекторными функциями (Ohba et al, 2004). Мыши, лишенные гена ХСЕ, развиваются нормально, но умирают сразу после рождения из-за невозможности расправления легких (Schweizer et al, 1999). Поскольку пока не обнаружены физиологические субстраты для ECEL-1/DINE, механизм их нейропротекторного действия и контроля дыхания остается не ясным.
К нетипичным представителям семейства М13 и НЕП относится гомолог эндопептидазы, регулирующей фосфатный обмен (РНЕХ - phosphate regulating endopeptidase homologue X), ассоциированный с X хромосомой). Отличие данного фермента от других представителей М13 состоит в том, что в его S1 сайте преобладают кислотные остатки (Campos et al, 2003). Другой гомолог НЕП, получивший название Kell по имени пациента, представляет собой важный антиген группы крови, который также обнаружен в клетках Сертоли извитых канальцев семенников млекопитающих (Lee et al, 1999; Camara-Clayette et al, 2001). Kell способен конвертировать большой эндотелин-3 в биологически активный эндотелин-3 (Lee et al, 1999). Данный фермент также относится к нетипичным представителям М13 семейства, поскольку не имеет трансмембранного домена, а вместо этого ковалентно связан с мембранным белком ХК (Redman and Lee, 2004). Дефицит Kell не вызывает видимой патологии, однако пациенты, у которых отсутствует белок ХК, а соответственно нет связанного с мембраной клеток Kell, страдают от синдрома Маклеода (Redman and Lee, 2004).
Неприлизин (ЕС.3.4.24.11), известный также под названиями нейтральная эндопептидаза 24.11, CALLA (common acute lymphocytic leukemia (ALL) antigen - общий антиген острого лейкоза), энкефалиназа и антиген CD 10 (Brown et al, 1974; Schwartz et al, 1980; Letarte et al, 1988, для обзора см. Nalivaeva et al, 2012), представляет собой повсеместно распространенный интегральный мембранный белок второго типа, состоящий из 742 аминокислотных остатков, молекулярный вес которого в зависимости от степени гликозилирования колеблется от 85 до ПО кДа (Relton et al, 1983; Malfroy et al, 1988). Наиболее высокий уровень экспрессии НЕП наблюдается в почках, при этом в мозге и других тканях его содержание в несколько десятков раз ниже (Erdos and Skidgel, 1988). Активный центр НЕП обращен во внеклеточное пространство, что является идеальным для осуществления процессов деградации пептидов, локализованных во внеклеточном пространстве или ассоциированных с мембраной (Fukami et al, 2002).
Ген НЕП человека (ММЕ) картирован на хромосоме 3 в районе q25.1 - q25.2. Он состоит из 24 экзонов и характеризуется высокой консервативностью среди млекопитающих (D Adamio et al, 1989). Экспрессия гена НЕП контролируется, по крайней мере, двумя различными промоторами и варьирует в различных тканях. Альтернативный сплайсинг в 5 -некодируемой области приводит к образованию 4-х разных мРНК транскриптов, не затрагивая кодирующую область (Li et al, 1995). Молекула НЕП представлена коротким N-концевым цитоплазматическим доменом, одиночной трансмембранной спиралью и большим внеклеточным доменом, содержащим типичный НЕХХН цинк-связывающий мотив (His-Glu-Xaa-Xaa-His, где Хаа - гидрофобный аминокислотный остаток или треонин), который важен для протеолиза различных субстратов НЕП (Barnes et al, 1995; Turner et al., 2001).
Оптимум pH НЕП соответствует 6.0 (Kerr and Kenny, 1974). Его активность ингибируют реагенты, хелатирующие цинк. На общей основе ингибиторов цинк-зависимых металлопептидаз были сконструированы мощные ингибиторы НЕП, первым из
которых был тиорафан ([dl-3-mercapto-2-benzylpropanoyl]-glycine) (Ki = 2.3 nM) (Roques et al, 1980). Еще один широко применяемый ингибитор НЕП, фосфорамидон, также ингибирует ЕКФ-1. В противоположность матричным металлопротеиназам НЕП не встречается в виде проэнзима и его активность не контролируется эндогенными ингибиторами, хотя пептиды, выделяющиеся в ответ на стресс, такие как сиалорфин и другие «опиорфины» могут регулировать НЕП (Rougeot et al, 2003). В частности, сиалорфин, защищая эндогенные энкефалины, обладает анальгезирующим эффектом в ответ на повреждение тканей.
НЕП представляет собой олигопептидазу, гидролизующую пептиды размером 40-50 аминокислотных остатков (Рис. 1). Эффективность его действия снижается с увеличением длины пептидов. Одним из наиболее эффективно расщепляемых субстратов НЕП является субстанция Р (Matsas et al, 1984). Субстратная специфичность НЕП изучалась с помощью большого числа естественных и синтетических пептидов, для большинства которых физиологическая роль пока не установлена. Основными физиологически значимыми субстратами НЕП in vivo являются энкефалины, тахикинины (к которым относится субстанция Р), эндотелины, брадикинин и предсердный натрийуретический пептид.
Таким образом, ингибиторы НЕП обладают потенциалом в терапии болевых синдромов, воспаления и сердечнососудистых заболеваний (Roques and Beaumont, 1990). Более того, активность НЕП идентична эластазе фибробластов человека вследствие чего ее стали рассматривать в качестве терапевтической мишени для лечения и предупреждения старения и повреждения кожи (Morisaki et al, 2010).
Оценка кратковременной и долговременной памяти в модифицированном тесте «распознавание новых объектов»
Количество белка в пробах плазмы крови и мембранных фракций структур мозга определяли по методу М.М. Брэдфорд (Bradford, 1976), который основан на связывании красителя кумасси синий G-250 с белками для определения концентрации белков в биологических жидкостях. Краситель способен связываться с положительно заряженными аминогруппами аминокислот, входящих в состав белковой молекулы, с образованием комплекса с максимумом поглощения при 595 нм (максимум поглощения красителя - 465 нм). Образование комплекса заканчивается через 2 мин после добавления красителя в среду, его окраска стабильна в течение часа. Для проведения реакции к аликвоте исследуемых фракций (10 мкл) добавляли реактив Бред форд (90 мкл). В результате пробы окрашивалась в синий цвет, интенсивность окраски которого измеряли фотометрированием при длине волны 595 нм. Стандартная кривая строилась с использованием у-глобулина (1 мг/мл).
Достоинствами данного метода является то, что комплекс белок-краситель обладает интенсивным поглощением, обеспечивая методу высокую чувствительность, и требует для исследования небольшого объема образца.
Для определения концентрации белка в лизате клеток использовали бицинхониновый метод (Smith et al, 1985). Для этого 1 мкл лизата клеток разбавляли до 10 мкл водой и помещали в лунки 96-луночного планшета. В качестве контроля использовалась вода, а в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл. Перед началом реакции 200 мкл рабочего раствора 4% СиБОУбицинхониновая кислота в соотношении 1:50 добавляли в каждую лунку и инкубировали с пробами 30 минут при 37С. Далее величину поглощения измеряли при 562 нм на спектрофотометре FLUO star Omega multidetection microplate reader (BMG Labtech, Aylesbury, Англия) и содержание белка определяли по стандартной калибровочной кривой.
Белки разделяли с использованием ступенчатого электрофореза. Для разделения белков с молекулярным весом более 30 кДа использовали 8 % SDS-ПААГ, содержавший 4,6 мл воды, 2,7 мл 30% акриламидной смеси, 2,5 мл 1,5 М трис-HCI (рН 8,8), 100 мкл 10% SDS, 100 мкл 10% персульфата аммония (ПСА), 6 мкл тетраметилетилендиамина (TEMED). Образцы готовили с использованием буфера для проб (0,625 М Трис-HCI рН 6,8, 3%) SDS, 10%) глицерол, 5% 2-меркаптоэтанол, 3% бромфенолового синего) и кипятили в течение 5 минут при 96С. В качестве стандарта использовали набор окрашенных белковых фрагментов (10-250 кДа) (Bio-Rad). Пробы загружали в лунки концентрирующего геля, содержавшего 3 мл воды, 0,83 мл 30% акриламидной смеси, 1,26 мл 0,5 М трис-HCI (рН 6,8), 50 мкл 10% SDS, 250 мкл 10% персульфата аммония (ПСА), 100 мкл TEMED из расчета 25 мкг белка на лунку. Электрофорез проводили в электродном буфере, состоявшем из 0,5М трис-HCI (рН 6,8), 18,8% глицина и SDS 3%. Пробы проходили концентрирующий гель за 30 минут при 120V, при переходе проб в разделяющий гель напряжение повышали до 160 V. Разделение продолжали до выхода бромфенолового синего из разделяющего геля. Для проведения электрофоретического разделения использовали прибор Biorad electrophoresis system (Bio-Rad).
После электрофореза в ПААГ белки переносили на поливинилиденфторидные (PVDF) мембраны (Roche Diagnostics) с использованием блока для проведения электропереноса Biorad electrophoresis system (Bio-Rad). Перенос осуществляли при напряжении 100 V в течение часа в буфере для переноса (на 1 л воды: трис-НС1 47,9 мМ, глицин 38,6 мМ, метанол 100 мл, рН 8,3). Для того чтобы минимизировать неспецифическое связывание, мембраны инкубировали в течение часа при +4С в блокирующем растворе, содержавшем 5% сухого молока, растворенного в фосфатносолевом буфере (рН 6,8), и 0,1% раствор Tween 20. В работе использовали первичные антитела к основной форме НЕП (Anti-CD 10 antibody, Abeam abl26593; разведение 1:10000). Антитела разбавляли согласно инструкции в 5% молоке на фосфатносолевом буфере. Мембраны с перенесенными на них белками инкубировали в растворе первичных антител в течение 20 часов (ночь) при +4С при постоянном покачивании. Мембраны тщательно отмывали фосфатносолевым буфером 6 раз по 10 минут, а затем инкубировали 1 час с HRP-конъюгированными вторичными антителами против IgG кролика (Abeam, разведение 1:4000). Для визуализации фракций белков использовали окраску диаминобензидином (DAB) и Optiblot ECL Ultra Detect Kit (Abeam, ab 133409) согласно протоколу производителя.
Для изучения влияния гипоксии на уровень экспрессии и локализацию НЕП в клетках нейробластомы NB7 клетки выращивали на покровных стеклах размером 18 мм в диаметре, помещенных в 6-ячеечные планшеты для микротитрования, в стандартных или экспериментальных условиях в течение 2-3 дней (гипоксия 24 часа). Перед использованием покровные стекла стерилизовали автоклавированием или с помощью 70% этанола. После требуемого периода инкубации (2-3 дня) стекла с прикрепленными на них клетками промывали 3 раза 10 мМ трис-буфером (рН 7,2). Клетки фиксировали добавлением 2 мл охлажденной на льду смеси метанол: ацетон (1:1). После 3-часовой инкубации стекла опять промывали три раза трис-буфером и помещали на 30 минут при комнатной температуре в блокирующий раствор, содержавший 1% козлиную сыворотку и 0,2% раствор желатина в 10 мМ трис-буфере (рН 7,2). После этой процедуры клетки инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4С с соответствующими первичными антителами (разведение для НЕП 1:80, для GLUT1 -1:100) в блокирующем буфере (рН 7,2). По окончании инкубации стекла промывали 3 раза по 15 минут в 10 мМ трис-буфере и инкубировали в течение 30 минут со вторичными антителами (против мыши, разведение 1:1000), конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). В завершении стекла опять промывали 3 раза трис-буфером. Приготовленные образцы помещали на стекла для микроскопии, покрытые Vectashield (Vector Laboratories, Англия). Клетки просматривали с помощью иммерсионного объектива микроскопа Zeiss Axioskop Fluorescent Microscope (Германия), используя масло для микроскопии Х63. FITC-окрашенные клетки возбуждались при длине волны 494 нм и отраженный свет направлялся через эмиссионный фильтр на детектор, сопряженный с компьютером. Размерная шкала 10 мкм. Анализ полученных изображений проводился с помощью компьютерной программы Ac Quis Software (Syncroscopy, Англия). 2.20. Обследование пациентов с диагнозом МКС и болезнь Альгеймера
В исследовании приняли участие пациенты с диагнозами мягкого когнитивного снижения амнестического типа (а-МКС) и БА, наблюдавшиеся в отделе гериатрической психиатрии отделения болезни Альцгеймера и ассоциированных с ней расстройств научного центра психического здоровья Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НЦПЗ» РАМН) и пожилые люди, не имеющие нарушений когнитивных функций. Все испытуемые или их представители дали согласие на участие в тестировании их когнитивных функций и анализ биомаркеров плазмы крови. Возраст пациентов в среднем составлял 73±13 лет. В группах было приблизительно равное количество представителей обоих полов.
Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга интактных крыс
Из литературных данных известно, что С-концевой фрагмент белка предшественника амилоидного пептида (AICD) принимает участие в регуляции экспрессии НЕП (Belyaev et al, 2009), а также является мишенью для расщепления каспазами, поскольку имеет специфический сайт у остатка аспартата 664 (Weidemann et al, 1999, Gervais et al, 1999, Bertrand et al, 2001). Так, как нами было показано увеличение уровня активности каспаз при гипоксии, мы предположили, что снижение экспрессии и активности НЕП может быть связано с уменьшением содержания в клетках AICD и, как следствие, снижением его связывания с промотором гена НЕП. 4 3,5
Эффект гипоксии на уровень экспрессии мРНК каспазы -1, -8 и -9 и активность каспаз -3/-7. Уровни экспрессии: А - каспазы-1; Б - каспазы-8; В - каспазы-9, нормализованных относительно некодирующеи короткой ядерной U6 мРНК в клетках NB7, подвергнутых действию гипоксии в течении суток (1% Ог). Г - Уровни активность каспаз-3/-7 в клетках NB7, подвергнутых действию гипоксии в течение суток (1% (). -р 0,05; -р 0,01 Для оценки процента связывания AICD с промотором гена НЕП после гипоксии было проведено исследование с использованием метода иммунопреципитации хроматина. Показано, что после инкубации клеток в гипоксических условиях в течение 24 часов, процент связывания AICD с промотором гена НЕП снижался приблизительно в 5 раз (Рис. 15).
Поскольку основной каспазой, вовлеченной в расщепление AICD, является каспаза-3 (Gervais et al, 1999), с целью исследования влияния этого фермента на AICD-опосредованное изменение экспрессии НЕП, нами был проведен анализ влияния ингибитора каспазы-3 на активность НЕП. Для этого клетки были подвергнуты воздействию гипоксии с добавлением или при отсутствии в среде инкубации ингибитора каспазы-3 - Z-DEVD-FMK.
При анализе активности НЕП было обнаружено, что добавление ингибитора каспазы-3 в инкубационную среду приводит к восстановлению активности НЕП до 90% от контрольного уровня (Рис. 16). п
В результате проведенных экспериментов с использованием метода иммунопреципитации хроматина выявлено также, что в клетках, инкубировавшихся в присутствии ингибитора каспазы-3, уровень связывания транскрипционного фактора AICD с промотором гена НЕП приблизительно в 2,5 раза выше (Рис. 17) по сравнению с клетками, инкубировавшимися без данного ингибитора в гипоксических условиях.
Эффект гипоксии и ингибитора каспаз на изменение процента связывания AICD с промотором гена НЕП в культуре клеток нейробластомы человека NB7. - различия между группами достоверны при р 0,05. Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение активности и экспрессии НЕП при действии гипоксии связаны с изменением содержания С-концевого фрагмента белка предшественника амилоидного пептида (AICD) и процента его связывания с промотором гена НЕП вследствие его усиленного расщепления каспазами, активность которых повышена при гипоксии. Таким образом, выявлен один из возможных молекулярных механизмов регуляции активности НЕП при действии гипоксии.
В продолжение серии исследований по выявлению роли каспаз в регуляции экспрессии НЕП в условиях in vivo нами было проведено изучение влияния инъекций ингибитора каспазы-3 - Ac-DEVD-CHO на изменение экспрессии НЕП в ткани теменной коры крыс, в норме и после пренатальной гипоксии. Показано, что у крыс, перенесших пренатальную гипоксию на Е14, через три дня после введения ингибитора каспазы-3 - Ac-DEVD-CHO экспрессия НЕП повышалась на 13 % по сравнению с аналогичной группой крыс, которым не вводили ингибитор каспазы (Рис. 18. А, Б). Через месяц и два месяца после введения ингибитора каспазы-3 - Ac-DEVD-CHO экспрессия НЕП не отличалась от таковой у крыс, перенесших гипоксию на 14-й день эмбриогенеза.
Выяснено, что крысы, перенесшие пренатальную гипоксию, на 20-30 сутки после рождения имеют повышенное содержание (в 3,6 раз, р 0,05) и активность каспазы-3 (в 5,26 раз, р 0,05), по сравнению с контролем. При этом в коре у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, содержание НЕП было снижено на 35.8% (Рис.19, А, Б), a AICD на 44.1% (Рис.19, А, В) относительно величин, полученных у контрольных крыс.
Через 3-е суток после введения ингибитора каспазы-3 Ac-DEVD-CHO в коре мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию, наблюдалось снижение активности каспазы-3 (в 3,9 раз, р 0,05) до уровня активности, регистрируемой у контрольных крыс. При этом введение ингибитора приводило к повышению в коре мозга содержания AICD на 52.4% и НЕП на 20.8% по сравнению с крысами, перенесшими гипоксию, которым ингибитор не вводили (Рис.19, А, Б, В).
Важно отметить, что на фоне введения ингибитора каспазы-3, у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, также увеличивался уровень исследовательской деятельности в отношении нового объекта по сравнению с аналогичной группой крыс, которым ингибитор каспазы-3 не вводили (Рис. 20). Увеличение уровня исследовательской деятельности отмечено через месяц и два месяца после введения ингибитора.
Отставленный эффект пренатальной гипоксии и постнатального введения ингибитора каспазы-3 - Ac-DEVD-CHO на экспрессию НЕП в ткани теменной коре крыс через три дня (А) и один месяц (Б) после введения. - различия достоверны при р 0,05. Во вставке на панели Б представлена картина иммуноблотинга НЕП и Р-актина, который использовался в качестве контроля загрузки по белку. 1 -контрольные крысы; 2 - крысы, перенесшие гипоксию на Е14; 3 - через 3 сут после однократного i.v. введения ингибитора каспазы-3 крысам, перенесшим пренатальную гипоксию наЕ14. 8кДа
Иммунохимический анализ содержания НЕП и AICD в гомогенатах коры мозга крыс. А - картина электрофоретического разделения белков. Количественная оценка содержания НЕП (Б) и AICD (В) выражена относительно контрольного белка ф-актин). 1 - контрольные крысы; 2 - крысы, перенесшие гипоксию на Е14; 3 - через 3 сут после однократного i.v. введения ингибитора каспазы-3 крысам, перенесшим пренатальную гипоксию на Е14. - статистически значимые отличия от значений у контрольных крыс, # - статистически значимые отличия от значений у крыс, перенесших пренатальную гипоксию без введения ингибитора каспаз (р 0,05 U-критерий Манна-Уитни). 10 мин
Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение экспрессии неприлизина и содержание AICD при гипоксии in vivo
Как известно из литературных данных, регуляция уровня НЕП осуществляется путем конкурентного связывания AICD с промотором его гена, инактивация которого обусловлена присутствием на нем гистондеацетилаз (в частности, HDAC1 и HDAC3), которые поддерживают плотно упакованную конформацию хроматина на этом участке ДНК за счет деацетилирования нуклеосомных белков (Belyaev et al, 2009). Применение ингибиторов гистондеацетилаз трихостатина А и вальпроата натрия (VA) приводит к повышению способности AICD связываться с промоторм гена НЕП и повышать его транскрипцию, приводя тем самым к повышению экспрессии этого белка (Belyaev et al, 2009). Данные литературы свидетельствуют, что при гипоксии наблюдается снижение уровня ацетилирования гистонов в районе промотора гена НЕП, приводящее к снижению его экспрессии (Wang et al, 2011). Как было показано нами, введение VA крысам, перенесшим пренатальную гипоксию на El4, приводило к повышению активности НЕП в теменной коре и гиппокампе по сравнению с животными, которым вводили физраствор. У исследованных крыс, получавших VA, отмечалось улучшение краткосрочной и долговременной памяти, наблюдавшееся при проведении поведенческих тестов в двухуровневом 8-лучевом радиальном лабиринте и модифицированном тесте распознавания новых объектов. Полученные нами данные согласуются с данными экспериментов по введению вальпроата натрия in vitro и in vivo как на уровне изменения экспрессии и активности НЕП, так и на уровне поведенческих реакций и памяти у животных (Qing et al, 2008; Morrison et al, 2007; Kilgore et al, 2010; Zhuravin et al, 2011; Nalivaeva et al, 2012). Это представляет практический интерес, поскольку может быть использовано при разработке терапевтического подхода для лечения БА. Поскольку НЕП играет важную роль в расщеплении амилоидного пептида и рассматривается как один из основных ферментов регуляции его содержания в мозге, дефицит НЕП сейчас связывают с риском развития спорадической формы БА. Исследование биоптатов головного мозга и спинномозговая пункция является травматичными методами, не показанным людям пожилого и старческого возраста. В то время как, взятие образцов крови является малоинвазивным методом, а сама плазма крови - наиболее доступным для исследования клиническим материалом.
Известно, что при БА наблюдаются многочисленные метаболические изменения, приводящие, в том числе, к изменению содержания и активности ряда ферментов, в том числе и НЕП, в мозге и спинномозговой жидкости (Appleyard and Donal, 1992; Garcia-Ayllon et al, 2010; Huang et al, 2012). Также имеются сведения о наличии отрицательной корреляции между возрастом и уровнем экспрессии НЕП на уровне мРНК и белка в биоптатах мозга, полученных посмертно или при нейрохирургических операциях как у пациентов без деменции, так и у больных с диагнозом БА (Russo et al, 2005; Hellstrom-Lindahl et al, 2008; Miners et al, 2009). Согласно современным представлениям, при развитии деменции каждый пациент проходит своеобразную "промежуточную" стадию начальных когнитивных расстройств, не достигающих уровня деменции. На протяжении этой стадии имеющие место нарушения еще не достигают степени деменции, но уже приводят к затруднениям при осуществлении сложных повседневных действий и обучения (Яхно, 2006; Гаврилова, 2005; Petersen et al, 2001).
В ходе проведенного нами исследования было выявлено статистически значимое снижение активности НЕП, коррелирующее с уровнем развития деменции. Используя этот показатель, можно достоверно различить состояние пациентов, характерное для БА или а МКС. Полученные нами результаты по динамике активности НЕП имеют ту же тенденцию, что и опубликованные в литературе данные по исследованию НЕП в теменной и фронтальной коре головного мозга пациентов (Huang et al, 2012).
Важно отметить, что проведенные в последнее время исследования активности и содержания мРНК НЕП и его гомолога НЕП2 в спинномозговой жидкости и ткани мозга пациентов с мягкими когнитивными нарушениями демонстрируют промежуточное состояние активности ферментов между контрольной группой пациентов и пациентами с диагностированной БА. Содержание мРНК НЕП сильно варьирует в разных отделах головного мозга, а также отличается у представителей разного пола. Так у мужчин содержание мРНК НЕП выше, чем у женщин, что вероятно обусловлено различиями в гормональном фоне. Высказывается предположение, что в мужском организме имеется больше возможностей для снижения уровней Ар в мозге, за счет повышения андроген-регулируемой экспрессии НЕП и его гомолога, поэтому у них реже регистрируется переход от МКС к Б A (Huang et al, 2012).
Проведенное нами исследование активности НЕП в плазме крови продемонстрировало также возможность использования данного параметра для оценки эффективности терапевтических препаратов, применяемых в клинике для лечения пациентов с диагнозом мягкого когнитивного снижения и БА. Показано, что при лечении пациентов с диагнозом мягкого когнитивного снижения препаратом Цераксон (цитиколин), активность НЕП повышается до контрольных значений, в то время, как у пациентов, принимавших плацебо, изменений активности НЕП обнаружено не было. В литературе существуют сведения о том, что данный препарат эффективен при лечении когнитивных расстройств (Гаврилова и др., 2011) однако воздействие данного препарата на исследуемый нами фермент показано впервые. 5.
Проведенное в данной диссертационной работе исследование позволило получить приоритетные данные, характеризующие динамику экспрессии и активности металлопептидазы НЕП в ткани мозга и крови крыс, а также раскрывающие молекулярные механизмы регуляции экспрессии НЕП в нормальном онтогенезе млекопитающих и при действии патологических факторов. На клеточной модели (клетки нейробластомы NB7) показано, что при гипоксии повышается экспрессия и активность каспаз, а также снижается степень связывания транскрипционного фактора AICD, являющегося их субстратом, с промотором гена НЕП. Выяснено, что ингибиторы каспазы-3 позволяет регулировать экспрессию НЕП за счет увеличения связывания транскрипционного фактора AICD с промотором гена исследованного фермента. На зоотропной модели (крысы после гипоксии на Е14, имеющие когнитивные дисфункции в постнатальном онтогенезе) показано, что аналогичный механизм имеет место и у животных, и что применение ингибитора каспазы-3 приводит к восстановлению содержания AICD и активности НЕП у животных, подвергавшихся действию пренатальной гипоксии, до уровня, регистрируемого у контрольных крыс. Альтернативный механизм регуляции экспрессии НЕП путем ингибирования гистондеацетилаз вальпроатом натрия или воздействием антиоксиданта зеленого чая -эпигаллокатехин-3-галлата также приводит к восстановлению уровня активности НЕП в мозге до контрольных значений. При этом у всех групп животных с введением перечисленных выше соединений наблюдается улучшение процессов запоминания и обучения.
В работе впервые описана динамика активности НЕП в постнатальном онтогенезе крыс в норме и после действия пренатальной гипоксии на Е14. Выяснено, что как в ходе нормального постнатального онтогенеза, так и в ходе онтогенеза после пренатальной гипоксии в мозге имеет место снижение активности НЕП. При этом в поведенческих тестах было показано статистически достоверное снижение когнитивных функций у старых и гипоксических животных. Высказано предположение и получены экспериментальные факты, подтверждающие, что одним из механизмов нарушений поведенческих реакций в процессе старения или после пренатальной гипоксии является снижение экспрессии НЕП за счет уменьшения связывания транскрипционного фактора AICD с промотором гена НЕП, которое восстанавливается при действии ингибиторов каспаз или при ингибировании гистондеацетилаз. Выяснение механизмов регуляции экспрессии и активности НЕП, коррелирующих с изменением когнитивных функций в условиях действия патологии, позволяют предложить способы коррекции нарушений поведенческих реакций и когнитивных функций, индуцированных патологией, в частности, гипоксией. При проведении работы метод анализа активности НЕП был адаптирован для тестирования в плазме крови крыс и человека. Впервые установлено, что активность НЕП имеет разнонаправленные изменения в структурах мозга и плазме крови крыс, как в ходе постнатального онтогенеза, так и после гипоксии на Е14. Данные, полученные в ходе работы, продемонстрировали возможность использования активности НЕП в плазме крови человека в качестве диагностического критерия, который позволяет подтвердить диагноз а-МКС и наличие риска дальнейшего развития БА у пациентов с нарушениями внимания и памяти. Он позволяет с высокой точностью и скоростью проводить клинический анализ большого количества проб, при этом требуется небольшое количество крови, что очень актуально при работе с пожилыми людьми, которые тяжело переносят процедуры забора крови и зачастую имеют проблемы со свертываемостью. В работе впервые продемонстрировано наличие корреляции между уровнем снижения активности НЕП в плазме крови пациентов с диагнозом а-МКС и БА и степенью выраженности когнитивных нарушений по сравнению с показателями у пациентов без нарушений внимания и памяти. В работе также описаны изменения данного показателя при действии лекарственных препаратов, применяемых при лечении пациентов с а-МКС и БА. Эти данные могут быть положены в основу диагностического теста, позволяющего оценить степень развития патологических изменений и эффективность применяемых терапевтических средств.