Введение к работе
Актуальность проблем. Для изучения свойств иммуноглобулинов человека, являющихся центральным звеном гуморального иммунитета, большое значение имеет методы иммунохимического анализа, в основе которого лежит реакция антиген-антитело. Однако исключительная неоднородность антител по физико-химическим свойствам и специфичности взаимодействия во многих случаях является непреодолимым препятствием в исследованиях. Моноклональные антителз, являющиеся
; продуктом гибридных клеток - гибридом, полученных в результате
' слияния лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов, значительно расширяют возможности таких методов, т.к. являются химически гомоген-
. ными, имеют одинаковую специфичность, аффинность, направлены к
одной антигенной детерминанте.
В литературе имеются .данные об использовании моноклональных антител для изучения антигенной структуры иммуноглобулинов человека (Kubagawa et al., 1982; Арсеньева и др., 1990), аффинного выделения подклассов IgG (Harada et al., 1989), диагностики некоторых заболеваний (Morago et al., 1985; Kfercler et al., 1989; Ци-биногина и др., 1992). Однако далеко не все возможности использования моноклональных антител исчерпаны, остаются открытыми много вопросов, которые могут быть решены с их помощью. Так, например, до настоящего времени не решена проблема аффинного выделения отдельных подклассов иа поликлональной фракции IgG при физиологических значениях рН. и ионной силе раствора. При патологических состояниях организма часто нарушается реализация эффекторной функции IgG - связывания комплемента, которая играет одну из ключевых ролей в поддержании иммунного гомеостаза. В доступной нам литературе мы не нашли информации о попытках решить эту проблему с помощью моноклональных антител. Также нет сведений об использовании моноклональных антител в реакциях иммунопреципитации для диагностики парапротеинемии и определения типа легкой цепи IgG.
-Поэтому мы посчитали актуальным проведение исследования, направ?, ленного на решение этих проблей с помощью мышиных моноклональных антител.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось использование уникальных свойств . моноклональных антител против
иммуноглобулинов" человека в различных ишунохимических методах для изучения свойств иммуноглобулинов, а также исследование с помощью моноклональных антител к мелиттину (пептиду из яда пчелы) эффекторной функции иммуноглобулинов G - связывания комплемента.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
-
Получить штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующие моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека; изучить свойства полученных моноклональных антител: специфичность взаимодействия, субклассовую принадлежность, аффинность, способность к иммунопреципитации.
-
Моноклональные антитела, обладающие способностью образовывать с антигенов преципитационную решетку, использовать в реакциях иммунопреципитации для диагностики парапротеинемии G, М и определения типа легкой цепи иммуноглобулинов G.
-
На основе отобранных моноклональных антител получить имму-носорбенты для аффинного выделения при физиологических, значениях рН (рН 7,4) и ионной силе.раствора IgGl, IgG2 и lgG3 из поликло-нальной фракции IgG. ' , '
-
Получить штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующий моноклональные антитела к мелиттину , (пептиду из яда .пчелы), с помощью которых разработать способ определения комплемёнтфиксируюшйй активности иммуноглобулинов G.
.5. Изучить с помощью разработанного метода комплементфиксиру-ющую: активность сывороточных иммуноглобулинов G здоровых и Сольных хроническим лимфолейкозом лодей, . .
Научная новизна. В работе получены 12 новых штаммов гибридных культивируемых клеток животных Mus ..musculus L.- продуцентов моноклональных антител к иммуноглобулинам человека.
Выявлены моноклональные антитела,, обладающие способностью образовывать преципитационную решетку с антигеном. Обнаруженные свойства использованыв реакциях иммунопреципитации для диагностики парапротеинемии G, М и определения, типа легкой цепи иммуноглобулинов G.
Созданы иммуносорбенты для аффинного выделения второго, третьего и четвертого подклассов IgG при физиологических значениях рН (рН 7,4) и ионной силе раствора.
Аффинно выделен и охарактеризован моноклональныи igG4 из сы-
-.?&*
воротки крови больного с парапротеинемией, сопутствующей злокачественной опухоли желудка (при отсутствии миеломной болезни).
Получек новый шташ гибридных' культивируемых клеток животных I&s musculue L.- продуцегг моноклоналышх антител к мелиттину, с помощью которых разработан.способ определения комплементфиксирую-щей активности IgG.
С помощью разработанного метода определены константы диссоциации комплекса ' IgG с первым фактором системы комплемента (Clq) в норме и при хроническом лимфолейкозе.
Практическая ценность. По материалам диссертации" получены 12 патентов.Российской Федерации. Созданные в работе моноклонадыше антитела могут быть использованы в различных биохимических, имму-. нологических и клинических исследованиях. В ходе работы был сделан ряд методич^аких рекомендаций. Предложено использовать монок-лональные антитела в реациях имцунопреципитации для диагностики парапротеинемии G, М и определения типа легкой цепи IgG. Получены иммуносорбенты для аффинного выделения при физиологических значениях рН и ионной силе раствора второго, третьего и четвертого подклассов IgG человека.
Разработан способ, позволяющий определять комплементфиксирую-щую активность ' IgG человека с помощью мышиных мококлональвых антител.1 Цоноклональные антитела к мелиттину были использованы в Институте биохимии АН .Украины им.А.В.Палладина, (Костржевская и др.,1992) для изучения взаимодействия ыелиттина с липвдной мембраной (акт внедрения от 17.03.93).
Работа.проводилась.в рамках программы 0.74.05 ГКНТ и АН СССР "Исследование межмолекулярных взаимодействий в иммунной системе в норме и патологии" (задание 17Н2) и в соответствии с заданием ГКНТ Украины (капр.б, N 5/321):."Получение цоноклональных антител и использование их как иммунодиагностйкумов при патологии и в' . экологически неблагоприятных условиях". ';';"...
Апробация работы, материалы диссертации были доложены на 10 Международном симпозиуме "Структура, биосинтез к функции макромолекул иммунной системы" (Краков, 1989), на VI Украинском биохимическом съезде (Киев,- 1992), на 57 молодежной научной конференции (Уфа; 1992), а также на заседаниях Крымского отделения Украинского биохимического общества и научных конференциях кафедры биохи-~мт Крымского медицинского института (Симферополь).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных
-4--работ. '
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, Еклвчая 12 таблиц и 15 рисунков. Работа состоит из введения, тести глав, выводов и списка литературы.! Список литературы содержит 218 ссылок на работы отечественных! и зарубежных авторов.
; СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ