Введение к работе
Актуальность проблемы. Первым этапом реализации генетической информации является транскрипция. Для осуществления этого процесса РНК-полимераза должна узнать и специфически связаться с определенными участками ДНК- промоторами. Узнавание ферментом нуклеотидных последовательностей промоторов и связывание с ними является критической стадией в инициации транскрипции генов и представляет один из основных механизмов регуляции транскрипции. К тому времени, когда начиналась данная работа методами футпринтинга, химической модификации ДНК, сайт-направленного мутагенеза, в промоторах генов прокариот было установлено существование двух областей гомологии: "-I0" и "-35", и определены их консенсусные последовательности (ТАТААТ и TTGACA, соответственно). Но используемые методы и протяженные участки промоторов не позволили оценить сродство РНК-полимеразы к отдельным функциональным участкам промотора, к транскрибируемой и нетранскрибируемой нитям ДНК в пределах одной области гомологии промотора. Хотя такая информация способствовала бы лучшему пониманию механизмов взаимодействия РНК-полимеразы с короткими фрагментами нуклеиновых кислот и, в частности, дискретных шагов процесса взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. Актуальность изучения взаимодействия РНК-полимеразы с олигонуклеотидами и их реакционноспособными аналогами обусловлена также тем, что оли-гонуклеотиды, способные к образовании специфических комплексов с РНК-полимеразой, перспективны в качестве средств для избирательного подавления развития определенных микроорганизмов и вирусов.
Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в изучении взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с короткими фрагментами нуклеиновых кислот, идентичными участкам spc промотора генов рибосомных белков E.coli. Это предполагало решение следующих задач: I) определить сродство РНК-полимеразы E.coli к олигодезоксирибонук-леотидам, идентичным транскрибируемой и нетранскрибируемой нитям ДНК "-35" и "-I0" областей spc промотора генов рибосомных белков
-I-
E.ooli; 2) изучить взаимодействие фермента с модифицированными по 5'-концевому фосфату олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными отдельным областям гомологии зрс промотора; 3) изучить влияние последовательностей, расположенных на 3'-конце "-I0" области spc промотора, на взаимодействие с РНК-полимеразой E.coli; 4) исследовать возможность взаимодействия изолированной о-субъединицы с олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными "-I0" и "-35" областям spc цромотора; 5) изучить взаимодействие РНК-полимеразы E.coli с синтетическими олигорибонуклеотидами, гомологичными "-I0" и "-35" областям зрс промотора.
Научная новизна и практическая ценность. Показано, что рнк-по-лимераза E.coli связывает олигодезоксирибонуклеотиды, идентичные "-I0" области нетранскрибируемой нити ДНК зрс промотора генов рибосомных белков E.coli, почти в 300 раз более эффективно, чем транскрибируемой нити. Обнаружено, что модифицированный по 5'-концевому фосфату двуцепочечный олигодезоксирибонуклеотид, идентичный "-I0" области spc промотора, образует ковалентный комплекс с Р'-, р-субъединицами фермента, а модифщированный олигодезоксирибонуклеотид, идентичный "-I0" области транскрибируемой нити ДНК spc .промотора- с р'-, р- и О-субъединицами. Изучено влияние последовательностей, расположенных на 3'-конце "-I0" области spc промотора, на взаимодействие с РНК-полимеразой и показано, что наибольшим сродством к ферменту обладает олигодезоксирибонуклеотид с С-трактом на 3'-конце ТАТА-блока. Впервые показано, что РНК-полимераза E.coli эффективно связывает олигорибонуклеотиды, гомологичные "-I0" области транскрибируемой нити зрс промотора. Эти олигорибонуклеотиды конкурентно тормозят транскрипцию, катализируемую РНК-полимеразой E.coli. Модифицированный по 5'-концевому фосфату аффинный олигорибонуклеотид образует ковалентный
комплекс с В'- и р-субъединицами фермента. Впервые получены дан-
70 ше о способности изолированной о -субъединицы связывать олигодезоксирибонуклеотиды, идентичные "-I0" и "-35" областям зрс
промотора.
Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы докладывались на Советско-Британском симпозиуме "Регуляция транскрипции" (Москва, 1990) представлялись в виде тезисов на 20-й конференции ФЕБО (Будапешт, 1990), Российско-Французском симпозиуме "Регуляция вкспрессии генов" (Новосибирск, 1995).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 100 страницах, включая 15 рисунков, 7 таблиц и список литературы (108 ссылок). Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части и выводов.
