Введение к работе
Актуальность проблеми. Альфа-І-антатрапсин (AT) - ото гдп-
копротеин плаз.мы крова, принадлекащий-к семеііству белков-шігп-
биторов оераноБнх протеаз' (оершшов). Основная физиологическая .
Функция AT - это подавление активности эластазы - фермента, *
разрушающего эластические мембраны а выделяемого нєіітрофальними
лейкоцитами. -.......-.'". -";" ."' '
Наследственная недостаточность AT является одним аз часто встречающихся -аутосошо-роцессившх заболевании (1/2000-1/^500 в различных популяциях Европы и Северной Америки). Основное клиническое проявлеіше болезни --развитие первичной 3:.їі.'І13ЄШ легшие - связано о неконтролируемой деградацией эластических мембран альвеолярной ткани, обусловленной дефицитом AT и енкке-. нием аниэластазного барьера., ,
Наиболее эффективный путь.предудрезденая'".! лечения клйни-
. чеекмх проявленні;' недостаточности AT - это повышение антислас-
тазного барьера легочішх альвеол, которое мо.~ет быть достигнуто
двумя путяга. Первый состоит в разработке методов генетической
коррекции заболевания. В ряде работ, появившихся в последнее
вре;ля, сообщается о разработке способов введеная в легкие генно-
йнженерных конструкций обеспечнваэдах высокоэффективный синтез
AT, однако создание подобных конструкций сопряжено с рядом '
серьезных трудностей, в частности, с необходимостью^ подбора бе
зопасных ретроварусных-векмровЧ'СиШ^в.а.,'' .IS09; .'_ .'. .
' Roienfeldе.в^991).'Второй;путь связан о зам'ес'тителышм введени
ем препаратов AT. Однако для стабільного подаерздния гффектлв- -
ной концентрация AT в кровотоке требуется1введение I г AT в не-
-делю для каждого больного ( bo&weH е.а., 1986). Таким образом,
учитывая высокую частоту заболевания, еаёгодная потребность в
этом препарате мозег составить несколько'тонн AT в год, что ко
может быть реально обеспечено путем выделения природного белка
из крова человека. .. : -... "-"' '
Поэтому Наиболее реальной представляется заместительная терапия дефицита-AT, ориентированная ^ш-применение препаратов ре-. комбянантного'AT ЧрАтТ.
В ряде работ было показано, что рАТ, полученный при экспрессии в дроякевых клетках и клетках Е- toil ',' обладает, тоіх яе антиэластаэной активностью, что'и AT,-выделенный'из плазш.
3 опытах по' аэрозольному введений рекомбинангного AT было показано, что он 'достигает тканей легкого без существенной деградация ( Casolaro ' е.а.Д987; Hubbard е.а., 1989).
Одаа из основных трудностей терапевтического использования очищенного приходного AT заключается в интенсивном спонтанном окислении Met ^, находящегося в активном центре белка, что приводит к быстрой Енактивации AT. В связи с этим возникает проел чл не только создания бактерий - продуцентов рЛТ, но и сайт-адресованного одтагенеза ЛТ-кДНК, направленного на изменение аминокислотной последовательности реактивного центра AT и увеличения е^о функциональной стабильности при выделении и хранении ( [Jaiiat е.а., 1986; ftischoff e.a.,I99I).
Как задача получения генно-инженерного белка, так и разра- ботка моделей корреции наследственной недостаточности AT, требуют в первую очередь созданш рекоабииантных ДТЇК, обеопечиващих эдйсктлвшй синтез AT в гетерологичшх клетках.
Цели и задачи исследования. Основной целью работы является изучение закономерностей экспрессии рекомбшштішх ДКК, содеряа щах ген AT человека, в клетках E.coit . - Нагли были поставлены'следующие задачи:
-
Получить генно-инженерными методами полноразмерную АТ-kjIJIK. ' . . '
-
Создать рекомбянантные конструкции на основе различных экоцрессионких векторов, направляющих синтез AT в клетках В. со її
-
Исследовать зависимость экспрессии гена AT человека в клетках Е- coll от бактериальных регуляторних элементов и от структуры клонированной последовательности гена AT. :
-
Исследовать функциональную активность рекомбинанткого AT. '
-
Разработать методы выделения рєкоабинантного AT из клеток &.Є.СІІ .
Оспосже- положения, зынооимые на защиту:
ї. іїолучена полноразлюрная АТ-кДНК и на ее основе сконст
руированы экспресоаонше векторы, направляющие синтез рекомби
нанткого аль$а-1-антитрипсина под контролем tac- и trp -
г.ро.-.'.отороБ Е.соії . Получены шта.'.лИ бактерий, продуцирулцлх рА1
-
Рокомбкпшшшй'AT имеет молекулярную- шсоу 46 кДа; что соответствует молекулярної: массе негдикозклирсванного AT. Гибридный белок OmpF-лТ имеет молекулярную массу 48 кДа. -
-
Показано, что уровень синтеза рекоглбикактного AT определяется структурой о '-концевой части клонированной кДііК. Содер.тд- . шш рЛТ с 1-ой Н -концевой аминокислотой зрелог-о AT (бій- ) составляет 1.5$ тотального клеточного' белка,, седси-ак^е рАТ с делецией этой аминокислоту, а' также гибридного белка Ompf -AT -2.22. , .
-
Синтезируемый в клетках Є.еоії рекембинактнъы алкйа-1-интитрипсин представляет собой стабильный пйлипептлд, не дєгра-дарущціі в течение 2 часов культнвирования клеток t.colL
5. Рекомбинантнъш антитрипсин обладает ингибзторноіі актив
ностью по отношению к трипсину.
6. Разработана схема очистки рАТ из бактериальных- клеток;" -О помощьа комплекса хроыаТограаач^ских методов получен высоко-очащешшіі белок 0mp f -AT, имеющий молекулярную.массу 48 кДа.
Научная новизна работы. Выполненная -работа посвялена разработке и оптимизации подходов к получению рекс^бпыантного AT как потенциального лечебного препарата.
Получена полпоразмерная АТ-кДНК, на основе' которой впервые
разработаны оригинальные экспресскопнке конструкции и получены
штаммы клеток Е..СОІІ , активно синтезирующие AT человека... . -
Продемонстрирована- существенная заёкешюсть уровня экспрес
сии AT. от структуры 5 -конца клонированное последовательности
АТ-кдЖ. Разработана схема выделения рекембинантного .аль-Ха-1-^ .
актитрипсика из клеток.,E.colL * - '"'"
Каучно-практачеокое значение полученных результатов:
- Ї. Полученные рекомбинантные ДНК могут быть использованы б
качестве 'зондов пра проведении диагностики наследственной недо
статочное!" -,ЛТ. .",''
2. Создание штаммов Е.еоіі пролуцїфуяцихАЇут^иональпо
активны;; AT, и разработка метода его выделения дают возможность
изучения тераиеьтлческого-'ДсїйтвйЯ'рекокбина'йтног-о' AT в оксперя-
"" ментах, на лабораторных ;:сивотных.
3. Подамо этого, доступность ры.омбинантного AT делают его хорошим источником получения поликлональных антител против AT, что цряет а<леть принципиальное значение для создания тест-систем, используемых для диагностики недостаточности антитрипсина в клинической практике.
Апробация. Результаты работы были долокени па I Всесоюзном сед;ппаре по генной терапия, Киев, 1989; Всесоюзной школе-сешна-ре ;,:олодых ученых ":,Золекулярная биология и медицина", Ленинград, 1090 г., II Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия", ПІЇТІ "Повейше метода био-иняенеряи'', Путино, 1991 г., на научной конференции отдела моле-ку.ирной генетики }Ш РАМН, 1993 г. .
Структура диссертации. Диссертация изложена на III страницах к состоит кз, введения, обзора литературы (главц 1,2 и 3), материалов # методов исследования (глава 4), собственных исследований (глзш 5,6,7), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 23 рисунками. Список литературы содержит 121 работу на русском и английском языках.