Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Электрохимический анализ белков и пептидов (Обзор литературы)
1.1. Электрохимия белка 14
1.1.1. Историческая ретроспектива 14
1.1.2. Кофакторы 21
1.1.3. Аминокислоты 31
1.1.4. Перенос заряда на границе жидкость-жидкость 36
1.2. Некоторые теоретические аспекты вольтамперометрии 38
1.2.1. Перенос электрона на границе электрод-раствор 38
1.2.2. Обратимость электрохимической реакции 42
1.2.3. Методы и приемы вольтамперометрии 45
1.3. Электрохимические (био)сенсорные системы для детекции белков и пептидов
1.3.1. Окисление белков и пептидов за счет аминокислотных остатков
1.3.2. Перенос электрона в кофактор-содержащих белках 55
1.3.3. Косвенные электрохимические процессы 60
1.4. Коммерческие тест-системы для детекции белков «у постели 66
больного»
1.4.1. Анализ «у постели больного» 66
1.4.2. Диагностика острого инфаркта миокарда 76
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Реактивы, препараты и биообразцы 83
2.2. Оборудование и материалы 94
2.3. (Био)сенсоры: изготовление и измерение сигнала
2.3.1. Иммуносенсор для определения содержания миоглобина в плазме крови
2.3.2. Сенсор для диагностики инфаркта миокарда по «профилю» плазмы крови
2.3.3. Аптасенсор на тромбин на основе наночастиц серебра 99
2.3.4. Аптасенсор на тромбин на основе золотых наночастиц 100
2.4. Электрохимический анализ аминокислот, пептидов и белков 101
2.4.1. Аминокислоты и белки 101
2.4.2. Пептид амилоид-бета 102
2.5. Математические расчеты и моделирование 106
2.5.1. Молекулярное моделирование структур белков 106
2.5.2. Расчет активной площади поверхности электрода 107
2.5.3. Расчет константы скорости обратимой электрохимической реакции по Николсону
2.5.4. Хемометрический анализ 109
ГЛАВА 3. Электрохимические (био)сенсоры для диагностики инфаркта миокарда
3.1. Иммуносенсор для определения содержания миоглобина в плазме крови
3.2. Сенсор для диагностики инфаркта миокарда по «профилю» плазмы крови
ГЛАВА 4. Аптасенсоры для детекции тромбина 165
4.1. Аптасенсор на основе золотых наночастиц 165
4.2. Аптасенсор на основе наночастиц серебра 175
ГЛАВА 5. Электрохимическая активность белков и пептидов, обусловленная аминокислотными остатками
5.1. Электрохимическая активность и строение молекулы белка 184
5.2. Амилоид-бета: комплексообразование с ионами металлов и агрегация
Заключение 245
Выводы 247
Список сокращений и условных обозначений 249
Библиография 254
Благодарности
- Перенос заряда на границе жидкость-жидкость
- Сенсор для диагностики инфаркта миокарда по «профилю» плазмы крови
- Сенсор для диагностики инфаркта миокарда по «профилю» плазмы крови
- Аптасенсор на основе наночастиц серебра
Введение к работе
Актуальность исследования. Расширение и углубление знаний о строении и функциях белков и пептидов, выявление новых путей развития заболеваний и обнаружение ранних белковых биомаркеров как результат прогресса аналитических и биоинформационных технологий влечет за собой разработку устройств, доступных для массового пользователя. Неотъемлемой частью любого исследования, связанного с выделением, очисткой и характеристикой белка или пептида, является оценка его концентрации [Степанченко Н.С. и соавт., 2011]. В медицине белки и пептиды широко используют как вакцины и лекарственные препараты, компенсирующие недостаток определенных веществ в организме [Биохимия человека, Марри Р. и соавт., 2009, Т. 1–2]. Белки служат распознающими элементами (антитела) [Diaconu I. et al., 2013; Iqbal S.S. et al., 2000] и высокоселективными катализаторами (ферменты) [Wang J., 2008; Borgmann S. et al., 2005] в различных аналитических системах; они выступают в роли мишеней при поиске потенциальных лекарственных средств [Bruno R.D., Njar V.C.O., 2007; Kohno M. et al., 2011] и в качестве маркеров при диагностике заболеваний [Polanski M., Anderson N.L., 2006; Anderson L., 2005]. Так, перечень подтвержденных и потенциальных биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний насчитывает более 170 индивидуальных белков [Anderson L., 2005]. На наиболее специфичные из них разрабатывают диагностические тесты. В последние годы многие исследования in vitro и in vivo направлены на выявление белков и пептидов с посттрансляционными модификациями (ПТМ), чей уровень резко изменяется при возникновении заболеваний. Повреждение белков и пептидов путем окислительных модификаций и/или присоединения нитро- или нитрозогрупп имеет место в процессе старения, при воспалении, диабете, в патогенезе сердечно-сосудистых, нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера (БА), Паркинсона, Хантингтона) и онкологии [Pacher P. et al., 2007; Soskic V. et al., 2008]. Помимо изменений в аминокислотной последовательности белков и пептидов, при нейродегенеративных и прионовых заболеваниях найдены различные белковые (пептидные) агрегаты, возможно, вызывающие эти нарушения [Haass C., Selkoe D.J., 2007]. Ингибирование их образования – одна из перспективных стратегий терапии данных заболеваний [Carter M.D. et al., 2010].
В настоящее время в диагностике на основе белков-маркеров чаще всего используют количественные параметры, характеризующие их концентрацию или ферментативную активность. Существенно реже обращают внимание на качественные изменения, произошедшие в молекулах. Подобные изменения в белках и пептидах относят, прежде
всего, к генетическим нарушениям их первичной структуры [Клиническая биохимия, 2008].
В распоряжении специалистов имеется мощный спектр методов определения содержания
белков и установления их ферментативной активности. Однако общими недостатками
данных методов являются высокая стоимость оборудования и/или расходных материалов,
трудоемкость и продолжительность анализа. Определение белка с помощью указанных
методов требует в большинстве случаев лабораторных условий, квалифицированного
персонала и не реализовано в варианте «у постели больного» (point-of-care – англ. яз.).
Существующая потребность в надежных и относительно недорогих устройствах для
определения концентрации белков и пептидов и установления изменений в их структуре для
диагностики и биохимических исследований может быть удовлетворена посредством
создания различных сенсорных и биосенсорных систем. Электрохимические методы анализа
представляются наиболее перспективными для разработки таких устройств, благодаря
высокой чувствительности, широкому диапазону определяемых концентраций,
минимальному эффекту матрицы пробы, относительной дешевизне, простоте эксплуатации и возможности миниатюризации оборудования, а также разнообразию материалов электродов и их модификаторов. Сегодня электрохимические биосенсоры стали общедоступным средством самоконтроля во всем мире, в частности среди больных диабетом, но сфокусированы главным образом на определении метаболитов, в то время как детекцию биоаффинных взаимодействий проводят в основном оптическими методами. Одним из направлений развития химических сенсоров является персонализированная медицина [Turner A.P.F., 2013]. При этом биосенсоры пока не нашли своего применения в случаях острой травмы, послеоперационного периода, ухода за престарелыми и тяжелобольными, диагностики многих заболеваний и скрининга потенциальных лекарственных препаратов [Turner A., 2013]. Для создания биосенсорных систем, действующих по принципу «у постели больного» и доступных для широкого круга потребителей, необходима разработка новых способов детекции белков и пептидов. Конструирование электрохимических сенсоров для определения концентрации и установления изменений в структуре белков и пептидов может быть осуществлено как за счет использования электроактивных материалов (например, наночастиц металлов, проводящих полимеров), так и на основе собственной электроактивности белковых молекул, обусловленной редокс-активными простетическими группами [Borgmann S. et al., 2005] и/или электроактивными группами аминокислотных остатков [Brabec V., Mornstein V., 1980; Reynaud J.A. et al., 1980].
Исходя из вышесказанного, в работе были поставлены следующие цель и задачи:
Цель исследования: создание электрохимических биосенсорных и сенсорных систем для детекции белков и пептидов, регистрации комплексообразования, аминокислотных замен и модификаций в их структуре для применения в биохимии и медицине.
Задачи исследования:
1. Разработать способ количественного определения белков c использованием их
редокс-активных простетических групп и апробировать его на примере биосенсора для
детекции кардиомаркера миоглобина в образцах плазмы крови.
2. Разработать метод распознавания заболеваний на основе хемометрического анализа
вольтамперных кривых плазмы крови на примере острого инфаркта миокарда.
3. Разработать способ электрохимической детекции белков на основе сигнала
наночастиц металлов, нанесенных на поверхность электродов, и провести его проверку на
примере аптасенсоров на тромбин.
-
Найти зависимость между электрохимической активностью белков и пептидов и их структурой (аминокислотным составом и конформацией) и разработать методики регистрации агрегации белковых молекул, выявления аминокислотных замен и модификаций.
-
Изучить влияние ионов металлов на электрохимический сигнал окисления белков и пептидов и разработать процедуру регистрации образования комплексов между пептидами (белками) и ионами металлов.
Научная новизна работы состоит в том, что:
– разработана методология определения концентрации белков, содержащих редокс-активные простетические группы, путем регистрации прямого переноса электрона между электродом и редокс-активным кофактором;
– выявлена количественная зависимость электрохимического сигнала окисления белков от плотности электроактивных аминокислотных остатков (тирозина, триптофана и цистеина), локализованных на поверхности молекул;
– разработан способ регистрации образования комплексов между молекулами пептидов (белков) и ионами металлов, позволяющий проводить оценку влияния различных факторов на процесс комплексообразования;
– на основе регистрации электрохимических сигналов окисления электроактивных аминокислотных остатков продемонстрирована эффективность электрохимического анализа в детекции агрегации пептидов и выявлении аминокислотных замен и модификаций в их структуре;
– разработаны оригинальные способы детекции белков с помощью инверсионной вольтамперометрии на основе электрохимических сигналов наночастиц золота и серебра, нанесенных на поверхность электродов совместно с биораспознающими элементами;
– разработан метод распознавания острого инфаркта миокарда на основе хемометрического анализа характеристик вольтамперных кривых плазмы крови.
Теоретическая и практическая значимость работы состоит в том, что:
– разработаны доступные и удобные в использовании электрохимические способы детекции белков и пептидов как содержащих редокс-активные простетические группы, так и состоящих только из аминокислотных остатков; разработанные способы перспективны при конструировании сенсорных систем для анализа «у постели больного»;
– выявленная количественная взаимосвязь между строением белка (пептида) и параметрами электрохимического окисления его аминокислотных остатков принципиально важна для детекции белковых молекул и регистрации различных изменений в их структуре, таких как денатурация или агрегация, а также установления образования комплексов типа «белок-белок» и «белок-лиганд»;
– электрохимический анализ образования комплексов между пептидом амилоид-бета и ионами металлов предназначен для выявления факторов, влияющих на процесс комплексообразования, и изучения механизма развития болезни Альцгеймера;
– знания об электрохимическом окислении амилоида-бета за счет аминокислотных остатков легли в основу способов идентификации пептидов, регистрации агрегации и выявления аминокислотных замен и модификаций;
– создан иммуносенсор для определения содержания миоглобина – раннего маркера острого инфаркта миокарда;
– разработан метод распознавания острого инфаркта миокарда путем регистрации и хемометрического анализа вольтамперных кривых плазмы крови пациента.
Методология и методы диссертационного исследования. Работа построена на базе биохимических знаний о строении и функциях белков и пептидов с использованием методологии и методов электрохимического анализа (циклическая, инверсионная, квадратно-волновая вольтамперометрия) в комплексе с другими физико-химическими методами (сканирующая электронная микроскопия, спектрофотометрия, динамическое светорассеяние и др.), математической статистикой и молекулярным моделированием.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Способ определения концентрации белков c использованием их редокс-активных
простетических групп на примере иммуносенсора для детекции кардиомаркера миоглобина в
образцах плазмы крови.
2. Метод распознавания заболеваний на основе хемометрического анализа
вольтамперных кривых плазмы крови на примере острого инфаркта миокарда.
-
Способ определения концентрации белков за счет изменения электрохимического сигнала наночастиц серебра и золота, нанесенных на поверхность электрода совместно с биораспознающим элементом, на примере аптасенсоров на тромбин.
-
Установленные закономерности между числом и расположением электроактивных аминокислотных остатков (тирозина, триптофана и цистеина) белка и сигналом его электрохимического окисления.
-
Способ регистрации образования комплексов между молекулами пептидов (белков) и ионами металлов, позволяющий проводить оценку влияния различных факторов на процесс комплексообразования.
-
Электрохимическая детекция агрегации, аминокислотных замен и модификаций в пептидах на основе сигналов окисления электроактивных аминокислотных остатков.
Личный вклад соискателя. Все описанные в диссертационной работе результаты,
касающиеся разработки электрохимических способов измерения и новых подходов к анализу
белков и пептидов, получены автором лично. Диссертант самостоятельно спланировал и
выполнил всю электрохимическую экспериментальную часть и принимал непосредственное
участие в постановке и решении задач по проведению исследований c помощью
дополнительных физико-химических методов, математической обработке
электрохимических данных и анализу трехмерных структур белков. Соискатель является автором научных публикаций по теме диссертации и лично выступал с докладами на российских и международных конференциях. При подготовке диссертации автор провел глубокий анализ литературных данных по теме исследования. Соавторами публикаций, отражающих научное содержание диссертации, являются специалисты, ответственные за синтез аптамеров к тромбину; сбор образцов плазмы крови и определение концентрации биомаркеров острого инфаркта миокарда независимым методом; определение общего белка; статистический анализ данных на основе вольтамперных кривых плазмы крови для диагностики острого инфаркта миокарда; оценку расположения аминокислотных остатков в молекулах белков; результаты вспомогательных экспериментов.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждена соответствующими статистическими характеристиками воспроизводимости экспериментальных данных и независимыми методами анализа. Результаты работы согласуются с известными теоретическими и практическими знаниями по теме диссертации, полученными другими группами исследователей с помощью электрохимических или альтернативных физико-химических и биохимических методов.
Основные положения диссертационной работы были представлены в виде устных докладов и стендовых сообщений на российских и международных конференциях: VII, VIII и IX Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА» (Уфа-Абзаково, 2008, 2012 – грамота за лучший пленарный доклад; Екатеринбург, 2016); VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009 – диплом победителя конкурса молодых ученых); II и IV Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009 – 3-е место международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, 2011); 5-й Международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанобиотехнологии для медицины» (Санкт-Петербург, 2010); I и II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010, 2012 – диплом за лучший стендовый доклад); 5-м Международном симпозиуме по модификации поверхности для химической и биохимической детекции (Лохов, Польша, 2011); 64-м и 65-м Годовом съезде международного электрохимического общества (Сантьяго де Керетаро, Мексика, 2013; Лозанна, Швейцария, 2014); Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013); VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2015); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в комплексном развитии регионов» (Москва, 2016).
Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 40 работ, в том числе 19 статей в научных рецензируемых изданиях: из них 5 в российских и 14 в международных научных журналах, 2 главы в коллективных монографиях, 2 патента и 17 публикаций в материалах конференций. Индекс Хирша автора составляет 11 по данным систем Scopus и Web of Science.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 290 страницах машинописного текста, включает 101 рисунок и 25 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и библиографии, содержащей 360 наименований отечественной и зарубежной литературы.
Диссертация выполнена при поддержке Федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-
технологического комплекса России на 2007–2012 годы»: ГК № 02.512.11.2212 «Разработка
экспериментальной схемы усиления биосенсорного сигнала для количественного
определения биохимических маркеров острой стадии инфаркта миокарда»;
ГК № 16.512.11.2215 «Разработка макетов электрохимических сенсоров для экспресс-диагностики инфаркта миокарда с использованием наноэлектродов»; Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы: ГК № 02.740.11.0306 «Фундаментальные методы протеомного профилирования плазмы крови человека в норме и патологии»; Соглашение о предоставлении гранта в форме субсидии № 8806 «Создание электрохимических биосенсорных систем медицинского назначения»; Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014– 2020 годы»: Соглашение о предоставлении субсидии № 14.604.21.0074 «Разработка электрохимического сенсора патогенной агрегации бета-амилоида при болезни Альцгеймера».
Перенос заряда на границе жидкость-жидкость
Подобный эффект каталитического выделения водорода наблюдал и R. Brdicka в 1933 г. [47], когда пытался подавить сигнал кобальта на фоне аммиачного буфера сывороткой крови: сигнал был подавлен, но при потенциалах, более положительных, чем для «преднатриевой», появилась новая четко выраженная двойная волна. Данное явление было названо «каталитическая реакция Брдички». Из аминокислот только цистин (Цис-Цис) и Цис давали рост этой волны (рис. 1.1.1). Высота новой волны была в сотни раз больше, чем сигнал восстановления SS-групп Цис-Цис, что говорило о ее каталитической природе. Так как высота каталитической волны для Цис была в два раза ниже, чем для Цис-Цис при той же концентрации, R. Brdicka заключил, что происходит восстановление SS-групп Цис-Цис до SH-групп, а SH-группы в свою очередь служат источниками ионов водорода для регистрируемого сигнала [48]. С помощью данного метода был проведен анализ более 250 образцов сыворотки крови онкологических больных и здоровых доноров, который выявил существенное отличие между ними [49]. Так, в случае сыворотки крови онкобольных высота характеристической волны была всегда ниже, чем для сыворотки здоровых доноров. После обработки образцов сывороток щелочью сигнал возрастал, но в случае онкобольных в меньшей степени, чем в норме, что объяснялось высвобождением сульфгидрильных и дисульфидных групп при денатурации белков. Количество Цис-Цис в каждом образце было определено колориметрически. Содержание белкового Цис-Цис в образцах крови онкологических больных было найдено меньшим, чем в норме. Отвечая на вопрос, какие из групп SH- или SS-ответственны за полярографическую реакцию, был сделан вывод, что наблюдаемый эффект относится главным образом к SS-группам [49]. Более глубокое исследование, проведенное на образах сыворотки крови от 386 человек, как онкологических больных, так и больных другими заболеваниями и здоровых доноров, выявило влияние температуры, возраста и вида опухоли на равновесие Цис-Цис г Цис [50]. С этого времени полярографическое изучение белков строилось главным образом на каталитических волнах в присутствии кобальта [51-53]. Каталитическая реакция Брдички нашла свое применение в биоанализе для определения Цис-содержащих белков, таких как металлотионеины [54, 55] и фитохелатины [56]. Считается, что катализаторами реакции выступают Цис- и/или Цис-Цис-содержащие белки, однако ее механизм до сих пор до конца не изучен [46].
В 1950-1960-е гг. расшифровка аминокислотной последовательности инсулина (F. Sanger, Нобелевская премия по химии 1958 г.) и получение трехмерных структур миоглобина (Мб) и гемоглобина (Гб) рентгеноструктурным анализом (F. Perutz и J.C. Kendrew, Нобелевская премия по химии 1962 г.) вывели исследования в области белков и аминокислот, включая электрохимические, на новый уровень. В 1960-х гг. было открыто полярографическое восстановление белков за счет дисульфидных связей Цис-Цис (RSSR) [57, 58]. Суммарное уравнение процессов, протекающих при этом на поверхности ртутного электрода, можно записать как (1.1.5) [59, 60]: RSSR + 2ё + 2Н+ - 2RSH. (1.1.5) Согласно механизму реакции, предложенному для восстановления Цис-Цис в [59], сначала происходит образование цистеината ртути(П) (1.1.6), а затем его восстановление (1.1.7): RSSR + Hg Hg(SR)2 (1.1.6) Hg(SR)2 + 2ё + 2Н+ г Hg + 2RSH (1.1.7) Другой механизм был предложен для реакции восстановления окисленной формы глутатиона (GSSG) (1.1.8-1.1.9) [60]: GSSG + ё + Н+ г GS + GSH (1.1.8) GS + ё+ Н+ GSH (1.1.9)
Отметим, что для каталитического электровосстановления водорода в присутствии белка и ранее требовалось восстановление SS-групп остатков Цис-Цис, но сообщений такого рода не было опубликовано. Объяснением этому противоречию может служить значительная разница высот двух типов волн. Токи восстановления SS-групп Цис-Цис белков составляют порядка 0.1 мкА, тогда как токи каталитических волн выделения водорода - 10-100 мкА. Таким образом, было необходимо достичь более высокой чувствительности измерения сигнала, чтобы зарегистрировать восстановление SS-мостиков, что было впервые продемонстрировано R. Cecil и P.D.J. Weitzman в 1964 г. [57] на примере инсулина и ряда других белков. При рН 1.0 все белки, содержащие SS-связи, давали одну волну, соответствующую восстановлению SS-групп. Высота данной волны росла с увеличением концентрации белка пока не выходила на предел. Ток, при котором наступало насыщение, зависел от природы белка, его молекулярной массы и числа SS-групп. При рН 7.1 и 9.2 после выхода на предел первой волны появлялась вторая, которая также отвечала за восстановление SS-групп. Потенциалы полуволн были равны, соответственно, около -0.65 В и -1 В (отн. НКЭ) (рис. 1.1.1). Объяснение наблюдаемых процессов вытекает из строения белка. Инсулин - белок с молекулярной массой 5.7 кДа, состоящий из двух полипептидных цепей (А и Б) и содержащий три SS-группы. Две SS-группы, соединяющие цепи А и Б, и третью -между 6 и 11 аминокислотными остатками цепи А. Восстановление межцепочечных SS-групп инсулина происходило при потенциале -1.35 В, а все три SS-связи восстанавливались при -1.8 В (рН 1.0). При наложении потенциала -2 В происходило восстановление всех четырех SS-групп рибонуклеазы - белка с молекулярной массой 13.7 кДа, состоящего из одной полипептидной цепи. Гб (64.5 кДа), содержащий шесть SH-групп и не имеющий SS-связей, не давал полярографических волн в тех же условиях, что белки с SS-группами (эксперименты проводили рН 9.2 из-за денатурации Гб в кислой среде). Известно, что SH-группы Цис (RSH) после предварительного полярографического окисления также образуют цистеинаты ртути(І) и ртути(П) и адсорбируются на поверхности электрода (1.1.10-1.1.11) [61, 62]: 2RSH + Hg г Hg(SR)2 + 2ё + 2Н+ (1.1.10) 2RSH + 2Hg г Hg2(SR)2 + 2ё + 2Н+ . (1.1.11) Определение белков и пептидов также возможно через восстановление образующейся связи Hg-S (1.1.7) (рис. 1.1.1). Позже, в 1970-х гг., изучение полярографического восстановления гемопротеинов выявило прямой перенос электрона между электродом и простетической группой, дав старт электрохимии кофактор-содержащих белков [63-65].
Отметим, что, несмотря на уникальные электрохимические свойства (возобновляемая поверхность и широкая рабочая область отрицательных потенциалов), ртутный электрод уходит в прошлое из-за своей высокой токсичности, уступая место электродам из твердых материалов (углерода, металлов и их оксидов). Тем не менее, ряд исследовательских групп продолжает изучать электрохимическое поведение различных белков на ртутном электроде. В настоящее время группа Е. Palecek строит свои исследования белков на (1) эффекте каталитического выделения водорода в присутствии и в отсутствие ионов кобальта; (2) восстановлении S-S и Hg-S связей, применяя ПХИА [66]. Истории электрохимии белков и исследованию механизмов реакций, протекающих на ртутном электроде, посвящены главы в коллективных монографиях [67].
Одновременно с развитием электрохимии белков в 1962 г. L.C. Clark и С. Lyons [35] предложили использовать белки-ферменты в «ферментных мембранных электродах». Раствор фермента (например, ГОД или уреазы) должен был быть помещен между двумя мембранами на поверхности электрода (рН-датчика, р02-датчика, проводящего электрода или другого сенсорного элемента), регистрирующего убыль субстрата или прирост продукта ферментативной реакции (рис. 1.1.2). В случае ГОД, превращающей глюкозу в глюконовую кислоту, согласно (1.1.12):
Сенсор для диагностики инфаркта миокарда по «профилю» плазмы крови
Из электроактивных аминокислотных остатков (раздел 1.1, рис. 1.1.6) для детекции белков наиболее часто используют Тир, Трп и Цис, окисляющиеся на поверхности твердых электродов в нейтральных рН при потенциале около 0.6–0.7 В (отн. Ag/AgCl). Разделение сигналов Тир, Трп и Цис требует специальных условий проведения эксперимента: выбора рН буферного раствора и материала электрода (например, электрода из допированного бором алмаза) [120]. В большинстве случаев регистрируют общий пик, относящийся к окислению всех трех аминокислот Тир, Трп и Цис. Окисление аминокислотных остатков Мет, Цис-Цис и Гис по сравнению с остатками Тир, Трп и Цис происходит при более высоких значениях потенциала, близких или превышающих 1 В (отн. Ag/AgCl) (раздел 1.1, рис. 1.1.7), вследствие этого получение четких сигналов не всегда возможно из-за мешающего влияния фона. С появлением электродов из новых материалов, например, электрода из допированного бором алмаза, обладающего широким рабочим диапазоном окислительных потенциалов, сигналы остатков Мет, Цис-Цис и Гис становятся предметом обсуждения в отдельных публикациях. Остановимся более подробно на возможностях и основных преимуществах электрохимии аминокислотных остатков для детекции белков.
Во-первых, окисление молекул белков и пептидов за счет аминокислотных остатков позволяет осуществить их прямое определение в достаточно низких концентрациях. Было показано, что различные пептиды, содержащие остаток Тир, способны необратимо окисляться на поверхности стеклоуглеродного электрода при потенциале 0.92–0.97 В (отн. Ag/AgCl) в кислой среде [145]. Окисление Тир-10 также было положено в основу сенсора для определения амилоида-бета (A) – пептида, играющего ключевую роль в патогенезе БА [146]. M. Chikae с соавторами [146] предложили электрохимический иммуносенсор для детекции A40 и A42 в микромолярных концентрациях за счет селективного связывания с молекулами сахарида, ковалентно связанными с поверхностью ПГЭ, модифицированного золотыми наночастицами (AuНЧ). Концентрация гормона пептидной природы, инсулина, была определена с помощью стеклоуглеродного электрода, модифицированного наночастицами SiC, амперометрическим проточно-инжекционным анализом с пределом обнаружения 3.3 пM [147]. В работе [116] исследовательская группа под руководством E. Palecek для определения инсулина использовала метод ПХИА (смотри раздел 1.1). Пептид предварительно концентрировали на поверхности угольно-пастового электрода при потенциале – 0.1 В (5 минут) и затем окисляли наложением постоянного тока в 3 мкА. Сигнал окисления регистрировали при частоте наложения потенциала 30 кГц. Предел обнаружения инсулина составил 2 нМ. Тем же методом и той же группой [148] было проведено сравнение электрохимических свойств трех биологически активных пептидов за счет окисления остатков Трп при 0.7 В и Тир при 0.55 В (отн. Ag/AgCl). Пептиды, содержащие по одному остатку Тир или Трп, давали один пик окисления в соответствующей области потенциалов, а пептид, содержащий оба остатка Тир или Трп, – пару хорошо различимых пиков. Пределы обнаружения пептидов данным методом лежат в области наномолярных концентраций. Еще более низкий предел обнаружения в 0.3 аМ был достигнут для белка стрептавидина при его окислении на угольно-пастовом электроде с предварительным накоплением в течение 10 минут и детекцией сигнала методом квадратно-волновой вольтамперометрии [117]. Представляет интерес иммуносенсор, предложенный для определения хориального гонадотропного гормона человека в моче [149]. На поверхность угольно-пастового электрода через карбодиимидную сшивку и белок А иммобилизовали соответствующие антитела к хориальному гонадотропному гормону человека. Сигналом иммуносенсора служила разность токов окисления при потенциале около 0.6 В (отн. Ag/AgCl) до и после связывания антигена. Авторы объясняют наблюдаемое увеличение тока окисления конформационными изменениями молекул гормона во время процесса связывания, что в свою очередь оказывало влияние на плотность упаковки антител. Предел обнаружения белка составил 15 пМ в искусственных образцах и 20 пM в образцах мочи. Другая высокоселективная и чувствительная стратегия детекции белка за счет его собственной электроактивности была предложена A.N. Kawde с соавторами [150]. Белок концентрировали с помощью магнитных частиц, покрытых молекулами аптамера, и затем методом ПХИА детектировали сигнал его окисления. Концентрация анализируемого белка – лизоцима – была определена в смеси, содержащей в несколько раз большие количества шести других белков и аминокислот с пределом обнаружения 350 фмоль (7 нМ).
Во-вторых, преимуществом регистрации электрохимического сигнала белка за счет аминокислотных остатков является чувствительность сигнала к изменениям в его структуре. Разворачивание (денатурация) молекул (например, под действием мочевины) приводит к значительному увеличению электрохимического сигнала окисления белка, что было показано на импрегнированном графитовом электроде [38]; на электроде из смешанного оксида индия и олова с комплексом полипиридина осмия в растворе в качестве редокс-медиатора [127]; на электроде из допированного бором алмаза [121] и на электроде из пиролитического графита [118]. Так, сравнительное исследование окисления альфа-2-макроглобулина в нативной и денатурированной формах было проведено на 4 типах электродов: стеклоуглеродном, золотом, электродах из проводящего алмаза и пиролитического графита [115]. При этом использовали предварительное накопление белка из раствора в течение 5 минут без наложения потенциала и послойную адсорбцию на поверхности электрода. Сигнал регистрировали методами квадратно-волновой и дифференциальной импульсной вольтамперометрии. На электроде из допированного бором алмаза, помимо Тир и Трп, были получены четкие сигналы окисления Гис при потенциале около 1.25 В (отн. Ag/AgCl). Было показало, что наибольшие отличия в токах окисления нативного и денатурированного белка наблюдались на стеклоуглеродном электроде. В работе [119] удалось различить мутантные формы ацетилхолинэстеразы с единичными аминокислотными заменами: сигнал окисления фермента на ПГЭ, измеренный методом квадратно-волновой вольтамперометрии, определялся числом электроактивных аминокислот и конформацией молекулы. Авторы подчеркивают, что наиболее сильный эффект на сигнал окисления оказывали конформационные изменения вследствие аминокислотных замен, чем замены аминокислот сами по себе.
Сенсор для диагностики инфаркта миокарда по «профилю» плазмы крови
Иммуносенсоры для определения концентрации Мб изготавливали следующим образом. На поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл (для ПГЭ ООО «Русенс») или 2 мкл (для ПГЭ ООО «АвтоКом» и ПГЭ фирмы DropSens) 5 мМ коллоидного раствора AuНЧ-ДДАБ, AgНЧ-ДДАБ или CuНЧ-ДДАБ. После испарения хлороформа поверх капали 1 мкл (для ПГЭ ООО «Русенс» и ПГЭ ООО «АвтоКом») или 2 мкл (для ПГЭ фирмы DropSens) раствора антител к Мб сердца человека 105 нг/мл в фосфатном буфере. Давали капле антител подсохнуть и оставляли иммуносенсоры на ночь при 4 оС. Определение Мб с помощью иммуносенсоров проводили так. На поверхность рабочего электрода иммуносенсора наносили 1 мкл (для ПГЭ ООО «Русенс») или 2 мкл (для ПГЭ ООО «АвтоКом» и фирмы DropSens) раствора Мб в фосфатном буфере, Мб в сыворотке крови или неразбавленного образца плазмы крови пациента с ОИМ или здорового донора. Иммуносенсор с образцом выдерживали при 37 оС в течение 15 минут. Затем иммуносенсор опускали в ячейку с 1 мл (или 4 мл для ПГЭ фирмы DropSens) фосфатного буфера (рН 7.4 или 6.5) и инкубировали при комнатной температуре или при 37 оС в течение 15 или 5 минут. Детали экспериментов указаны под соответствующими рисунками в разделе 3.1. Сигналом иммуносенсоров служил пик восстановления иона Fe(III) гема Мб. Вольтамперограмму регистрировали методом квадратно-волновой вольтамперометрии при следующих параметрах: начальный потенциал 0.1 В, конечный потенциал –0.6 В, амплитуда 20 мВ, шаг потенциала 5 мВ, частота квадратных волн 10 Гц.
В результате проведенных исследований по оптимизации конструкции иммуносенсора и процедуры определения Мб в образах плазмы крови были выбраны следующие условия. Иммуносенсор представлял собой ПГЭ ООО «Русенс»/AuНЧ-ДДАБ/анти-Мб и изготавливался последовательным нанесении на рабочую поверхность ПГЭ производства ООО «Русенс» 1 мкл коллоидного раствора AuНЧ-ДДАБ в хлороформе и 1 мкл раствора анти-Мб 105 нг/мкл в фосфатном буфере. Иммуносенсоры были готовы на следующий день после инкубации при 4 оС в течение ночи. Процедура определения Мб в образцах состояла из следующих стадий: (1) связывание Мб с антителами (1 мкл образца плазмы капали на рабочую поверхность иммуносенсора и выдерживали при 37 oC 15 минут); (2) отмывка неспецифически связанных молекул (5 минут при 37 oC в фосфатном буфере) и (3) электрохимическая регистрация сигнала (пик восстановления при потенциале около – 250 мВ). Оптимальный рН буферного раствора был найден в интервале значений от 6.5 до 7.4. Для измерения сигнала иммуносенсора был выбран метод квадратно-волновой вольтамперометрии (параметры указаны выше). Каждый иммуносенсор использовали однократно для одной процедуры измерения сигнала. Все экспериментальные точки на графиках получены путем вычисления средних значений из трех и более повторов.
Модификацию ПГЭ Tor Vergata и ПГЭ ООО «Русенс» сажей и УНТ проводили следующим образом. На ПГЭ наносили последовательно по 2 мкл дисперсии сажи или УНТ 1 г/л и давали растворителю испариться. Конечный объем нанесенных дисперсий составлял по 6 мкл на каждый электрод. Иммобилизация Мб на поверхность ПГЭ, модифицированного сажей или УНТ, осуществлялась так: на поверхность ПГЭ, предварительно модифицированного (или немодифицированного – контроль) сажей или УНТ, наносили 0.25 мкл (ПГЭ университета Tor Vergata) или 1 мкл (ПГЭ ООО «Русенс») 0.1 М раствора ДДАБ в хлороформе. После испарения растворителя поверх слоя ДДАБ капали 0.25 мкл (ПГЭ университета Tor Vergata) или 1 мкл (ПГЭ ООО «Русенс») раствора Мб скелетных мышц лошади и оставляли при 4 оС на ночь. Изготовление (иммуно)сенсоров на основе ПГЭ университета Tor Vergata и ООО «Русенс», модифицированных сажей, проводили так: на поверхность ПГЭ, модифицированного 6 мкл дисперсии сажи 1 г/л, наносили 0.25 мкл 0.1 М ДДАБ. После испарения хлороформа в случае иммуносенсоров на поверхность были иммобилизованы антитела 0.25 мкл 105 нг/мл анти-Мб в фосфатном буфере (рН 6.5) и оставлены на ночь при 4 оС. Процедура определения Мб заключалась в следующем: 0.25 мкл (ПГЭ университета Tor Vergata) или 1 мкл (ПГЭ ООО «Русенс») образца Мб в фосфатном буфере (или 0.25 мкл неразбавленной плазмы крови для иммуносенсоров на основе ПГЭ университета Tor Vergata) наносили на поверхность (иммуно)сенсора. (Иммуно)сенсор оставляли при 37 оС на 15 минут. Электрохимическое измерение сигнала проводили при комнатной температуре: 100 мкл буферного раствора капали на сенсор в горизонтальном режиме, чтобы закрыть все три электрода, и через 5 минут регистрировали вольтамперную кривую методом квадратно-волновой вольтамперометрии: начальный потенциал 0.1 В, конечный потенциал –0.6 В, высота импульса 20 мВ, шаг потенциала 5 мВ, частота квадратных волн 10 Гц.
Окисление иона Fe(II) гема Мб кислородом буферного раствора изучали с помощью биосенсоров, изготовленных следующим образом: на поверхность рабочего электрода ПГЭ ООО «Русенс» наносили 1 мкл 0.1 М ДДАБ. После испарения хлороформа поверх капали 1 мкл раствора Мб человека 1 г/л в фосфатном буфере рН 7.4 или плазме крови. После подсыхания аликвоты белка сенсоры инкубировали 15 минут при 37 оС. Сигналом биосенсора служил пик восстановления иона Fe(III) гема Мб. Биосенсоры подсоединяли к потенциостату в горизонтальном положении и наносили 100 мкл буферного раствора с рН 7.4 так, чтобы капля закрыла все три электрода: рабочий, вспомогательный и сравнения. После инкубации в буфере в течение 5 минут запускали процедуру наложения потенциала и регистрации квадратно-волновой вольтамперограммы при следующих параметрах: начальный потенциал 0.1 В, конечный потенциал –0.6 В, амплитуда 20 мВ, шаг потенциала 5 мВ, частота квадратных волн 10 Гц. Все экспериментальные точки на графиках получены путем вычисления среднего значения из трех и более повторов.
Аптасенсор на основе наночастиц серебра
В завершении раздела 3.1 подчеркнем, что идея использования явления прямого переноса электрона для количественного определения белка, заложенная в иммуносенсор на Мб, была подхвачена другими научными группами. Так, M. Pandiaraj с соавторами использовали ПГЭ, модифицированные золотыми наночастицами, полипирролом и моноклональными антителами, для определения концентрации другого гемопротеина – Цит c [175]. Предел обнаружения Цит c с помощью разработанного биосенсора составил 2 нМ с линейной областью определяемых концентраций 10–50 нМ. Результаты определения содержания Цит c в лизатах кардиомиоцитов, полученные с помощью биосенсора соответствовали данным стандартного твердофазного иммуноферментного анализа. Еще одна группа электрохимиков недавно опубликовала работу, посвященную прямому переносу электрона и биоэлектрокатализу гемопротеинов по отношению к пероксиду водорода на золотых электродах, модифицированных молекулярно-импринтированным полимером [294]. Задача количественного определения белков в данной работе не ставилась. Однако можно с уверенностью говорить о том, что в будущем совмещение распознающих свойств молекулярно-импринтированных полимеров с регистрацией прямого переноса электрона ляжет в основу электрохимических сенсоров для детекции гемопротеинов и других редокс-активных белков.
Таким образом, на примере Мб – белка-маркера ОИМ был разработан способ количественного определения редокс-активных белков, используя явление прямого переноса электрона. Прямой электрохимический анализ позволяет детектировать Мб на физиологическом уровне в норме и при возникновении ОИМ. Все этапы анализа занимают около 30 минут. На аналитические характеристики иммуносенсора влияют различные факторы: материал и модификатор рабочего электрода, рН и температура буферного раствора. Разработанная стратегия детекции редокс-активных белков и созданный иммуносенсор для определения содержания Мб, несомненно, найдут применение при конструировании портативных электрохимических устройств, работающих по принципу «у постели больного», для диагностики различных заболеваний и состояний.
Второй сенсор, разработанный для ранней диагностики ОИМ, основан на комбинации электрохимического анализа и хемометрики. Сенсор представляет собой ПГЭ, модифицированный ДДАБ (рис. 3.2.1). В отличие от традиционного иммуноанализа и электрохимического иммуносенсора для определения Мб, описанного в предыдущем разделе главы 3, разработанный сенсор не содержит в своем составе каких-либо биораспознающих элементов. Функционирование сенсора основано на регистрации электрохимического «профиля» (вольтамперограммы) исследуемого образца плазмы крови методами циклической и квадратно-волновой вольтамперометрии в заданном диапазоне потенциалов (глава 2, раздел 2.3.2 и рис. 3.2.2). При разработке сенсора использовали 25 образов плазмы крови, из них здоровых доноров – 9 и пациентов с ОИМ – 16 (глава 2, раздел 2.1). Все случаи ОИМ имели медицинское подтверждение. Каждый образец плазмы крови был охарактеризован данными об уровне белков-кардиомаркеров. Используя различные средства статистического анализа, было проведено разделение образцов плазмы крови больных с ОИМ и здоровых доноров по особенностям их электрохимических «профилей», в первую очередь по параметрам катодного пика с максимумом при –0.25 В, который обусловлен присутствием в плазме маркерных белков, ассоциированных с ОИМ.
Следует отметить, что прямой корреляции параметров пика с индивидуальными соединениями установлено не было, так же, как и не было проведено разделения катодного пика на составляющие, относящиеся к индивидуальным соединениям. Тем не менее, электрохимический сигнал позволил провести разделение образцов на соответствующие группы. Применимость электрохимического сенсора была подтверждена с помощью набора статистических методов, включающих обобщенную линейную модель (generalized linear model, GLM); линейный дискриминантный анализ (linear discriminant analysis, LDA), квадратичный дискриминантный анализ (quadratic discriminant analysis, QDA); искусственную нейронную сеть типа «многослойный перцептрон» (multi-layer perceptron, MLP), а также метод опорных векторов (support vector machine, SVM). С их помощью была установлена возможность определения заболевания путем отнесения образцов к двум классам: «Ложь», если прогнозный диагноз отличался от истинного, и «Истина», если он совпадал.