Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Супрун Елена Владимировна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Супрун Елена Владимировна. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ: диссертация ... доктора Биологических наук: 03.01.04 / Супрун Елена Владимировна;[Место защиты: ФГБНУ Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича], 2017.- 290 с.

Введение к работе

Актуальность исследования. Расширение и углубление знаний о строении и функциях белков и пептидов, выявление новых путей развития заболеваний и обнаружение ранних белковых биомаркеров как результат прогресса аналитических и биоинформационных технологий влечет за собой разработку устройств, доступных для массового пользователя. Неотъемлемой частью любого исследования, связанного с выделением, очисткой и характеристикой белка или пептида, является оценка его концентрации [Степанченко Н.С. и соавт., 2011]. В медицине белки и пептиды широко используют как вакцины и лекарственные препараты, компенсирующие недостаток определенных веществ в организме [Биохимия человека, Марри Р. и соавт., 2009, Т. 1–2]. Белки служат распознающими элементами (антитела) [Diaconu I. et al., 2013; Iqbal S.S. et al., 2000] и высокоселективными катализаторами (ферменты) [Wang J., 2008; Borgmann S. et al., 2005] в различных аналитических системах; они выступают в роли мишеней при поиске потенциальных лекарственных средств [Bruno R.D., Njar V.C.O., 2007; Kohno M. et al., 2011] и в качестве маркеров при диагностике заболеваний [Polanski M., Anderson N.L., 2006; Anderson L., 2005]. Так, перечень подтвержденных и потенциальных биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний насчитывает более 170 индивидуальных белков [Anderson L., 2005]. На наиболее специфичные из них разрабатывают диагностические тесты. В последние годы многие исследования in vitro и in vivo направлены на выявление белков и пептидов с посттрансляционными модификациями (ПТМ), чей уровень резко изменяется при возникновении заболеваний. Повреждение белков и пептидов путем окислительных модификаций и/или присоединения нитро- или нитрозогрупп имеет место в процессе старения, при воспалении, диабете, в патогенезе сердечно-сосудистых, нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера (БА), Паркинсона, Хантингтона) и онкологии [Pacher P. et al., 2007; Soskic V. et al., 2008]. Помимо изменений в аминокислотной последовательности белков и пептидов, при нейродегенеративных и прионовых заболеваниях найдены различные белковые (пептидные) агрегаты, возможно, вызывающие эти нарушения [Haass C., Selkoe D.J., 2007]. Ингибирование их образования – одна из перспективных стратегий терапии данных заболеваний [Carter M.D. et al., 2010].

В настоящее время в диагностике на основе белков-маркеров чаще всего используют количественные параметры, характеризующие их концентрацию или ферментативную активность. Существенно реже обращают внимание на качественные изменения, произошедшие в молекулах. Подобные изменения в белках и пептидах относят, прежде

всего, к генетическим нарушениям их первичной структуры [Клиническая биохимия, 2008].
В распоряжении специалистов имеется мощный спектр методов определения содержания
белков и установления их ферментативной активности. Однако общими недостатками
данных методов являются высокая стоимость оборудования и/или расходных материалов,
трудоемкость и продолжительность анализа. Определение белка с помощью указанных
методов требует в большинстве случаев лабораторных условий, квалифицированного
персонала и не реализовано в варианте «у постели больного» (point-of-care – англ. яз.).
Существующая потребность в надежных и относительно недорогих устройствах для
определения концентрации белков и пептидов и установления изменений в их структуре для
диагностики и биохимических исследований может быть удовлетворена посредством
создания различных сенсорных и биосенсорных систем. Электрохимические методы анализа
представляются наиболее перспективными для разработки таких устройств, благодаря
высокой чувствительности, широкому диапазону определяемых концентраций,

минимальному эффекту матрицы пробы, относительной дешевизне, простоте эксплуатации и возможности миниатюризации оборудования, а также разнообразию материалов электродов и их модификаторов. Сегодня электрохимические биосенсоры стали общедоступным средством самоконтроля во всем мире, в частности среди больных диабетом, но сфокусированы главным образом на определении метаболитов, в то время как детекцию биоаффинных взаимодействий проводят в основном оптическими методами. Одним из направлений развития химических сенсоров является персонализированная медицина [Turner A.P.F., 2013]. При этом биосенсоры пока не нашли своего применения в случаях острой травмы, послеоперационного периода, ухода за престарелыми и тяжелобольными, диагностики многих заболеваний и скрининга потенциальных лекарственных препаратов [Turner A., 2013]. Для создания биосенсорных систем, действующих по принципу «у постели больного» и доступных для широкого круга потребителей, необходима разработка новых способов детекции белков и пептидов. Конструирование электрохимических сенсоров для определения концентрации и установления изменений в структуре белков и пептидов может быть осуществлено как за счет использования электроактивных материалов (например, наночастиц металлов, проводящих полимеров), так и на основе собственной электроактивности белковых молекул, обусловленной редокс-активными простетическими группами [Borgmann S. et al., 2005] и/или электроактивными группами аминокислотных остатков [Brabec V., Mornstein V., 1980; Reynaud J.A. et al., 1980].

Исходя из вышесказанного, в работе были поставлены следующие цель и задачи:

Цель исследования: создание электрохимических биосенсорных и сенсорных систем для детекции белков и пептидов, регистрации комплексообразования, аминокислотных замен и модификаций в их структуре для применения в биохимии и медицине.

Задачи исследования:

1. Разработать способ количественного определения белков c использованием их
редокс-активных простетических групп и апробировать его на примере биосенсора для
детекции кардиомаркера миоглобина в образцах плазмы крови.

2. Разработать метод распознавания заболеваний на основе хемометрического анализа
вольтамперных кривых плазмы крови на примере острого инфаркта миокарда.

3. Разработать способ электрохимической детекции белков на основе сигнала
наночастиц металлов, нанесенных на поверхность электродов, и провести его проверку на
примере аптасенсоров на тромбин.

  1. Найти зависимость между электрохимической активностью белков и пептидов и их структурой (аминокислотным составом и конформацией) и разработать методики регистрации агрегации белковых молекул, выявления аминокислотных замен и модификаций.

  2. Изучить влияние ионов металлов на электрохимический сигнал окисления белков и пептидов и разработать процедуру регистрации образования комплексов между пептидами (белками) и ионами металлов.

Научная новизна работы состоит в том, что:

– разработана методология определения концентрации белков, содержащих редокс-активные простетические группы, путем регистрации прямого переноса электрона между электродом и редокс-активным кофактором;

– выявлена количественная зависимость электрохимического сигнала окисления белков от плотности электроактивных аминокислотных остатков (тирозина, триптофана и цистеина), локализованных на поверхности молекул;

– разработан способ регистрации образования комплексов между молекулами пептидов (белков) и ионами металлов, позволяющий проводить оценку влияния различных факторов на процесс комплексообразования;

– на основе регистрации электрохимических сигналов окисления электроактивных аминокислотных остатков продемонстрирована эффективность электрохимического анализа в детекции агрегации пептидов и выявлении аминокислотных замен и модификаций в их структуре;

– разработаны оригинальные способы детекции белков с помощью инверсионной вольтамперометрии на основе электрохимических сигналов наночастиц золота и серебра, нанесенных на поверхность электродов совместно с биораспознающими элементами;

– разработан метод распознавания острого инфаркта миокарда на основе хемометрического анализа характеристик вольтамперных кривых плазмы крови.

Теоретическая и практическая значимость работы состоит в том, что:

– разработаны доступные и удобные в использовании электрохимические способы детекции белков и пептидов как содержащих редокс-активные простетические группы, так и состоящих только из аминокислотных остатков; разработанные способы перспективны при конструировании сенсорных систем для анализа «у постели больного»;

– выявленная количественная взаимосвязь между строением белка (пептида) и параметрами электрохимического окисления его аминокислотных остатков принципиально важна для детекции белковых молекул и регистрации различных изменений в их структуре, таких как денатурация или агрегация, а также установления образования комплексов типа «белок-белок» и «белок-лиганд»;

– электрохимический анализ образования комплексов между пептидом амилоид-бета и ионами металлов предназначен для выявления факторов, влияющих на процесс комплексообразования, и изучения механизма развития болезни Альцгеймера;

– знания об электрохимическом окислении амилоида-бета за счет аминокислотных остатков легли в основу способов идентификации пептидов, регистрации агрегации и выявления аминокислотных замен и модификаций;

– создан иммуносенсор для определения содержания миоглобина – раннего маркера острого инфаркта миокарда;

– разработан метод распознавания острого инфаркта миокарда путем регистрации и хемометрического анализа вольтамперных кривых плазмы крови пациента.

Методология и методы диссертационного исследования. Работа построена на базе биохимических знаний о строении и функциях белков и пептидов с использованием методологии и методов электрохимического анализа (циклическая, инверсионная, квадратно-волновая вольтамперометрия) в комплексе с другими физико-химическими методами (сканирующая электронная микроскопия, спектрофотометрия, динамическое светорассеяние и др.), математической статистикой и молекулярным моделированием.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ определения концентрации белков c использованием их редокс-активных
простетических групп на примере иммуносенсора для детекции кардиомаркера миоглобина в
образцах плазмы крови.

2. Метод распознавания заболеваний на основе хемометрического анализа
вольтамперных кривых плазмы крови на примере острого инфаркта миокарда.

  1. Способ определения концентрации белков за счет изменения электрохимического сигнала наночастиц серебра и золота, нанесенных на поверхность электрода совместно с биораспознающим элементом, на примере аптасенсоров на тромбин.

  2. Установленные закономерности между числом и расположением электроактивных аминокислотных остатков (тирозина, триптофана и цистеина) белка и сигналом его электрохимического окисления.

  3. Способ регистрации образования комплексов между молекулами пептидов (белков) и ионами металлов, позволяющий проводить оценку влияния различных факторов на процесс комплексообразования.

  4. Электрохимическая детекция агрегации, аминокислотных замен и модификаций в пептидах на основе сигналов окисления электроактивных аминокислотных остатков.

Личный вклад соискателя. Все описанные в диссертационной работе результаты,
касающиеся разработки электрохимических способов измерения и новых подходов к анализу
белков и пептидов, получены автором лично. Диссертант самостоятельно спланировал и
выполнил всю электрохимическую экспериментальную часть и принимал непосредственное
участие в постановке и решении задач по проведению исследований c помощью
дополнительных физико-химических методов, математической обработке

электрохимических данных и анализу трехмерных структур белков. Соискатель является автором научных публикаций по теме диссертации и лично выступал с докладами на российских и международных конференциях. При подготовке диссертации автор провел глубокий анализ литературных данных по теме исследования. Соавторами публикаций, отражающих научное содержание диссертации, являются специалисты, ответственные за синтез аптамеров к тромбину; сбор образцов плазмы крови и определение концентрации биомаркеров острого инфаркта миокарда независимым методом; определение общего белка; статистический анализ данных на основе вольтамперных кривых плазмы крови для диагностики острого инфаркта миокарда; оценку расположения аминокислотных остатков в молекулах белков; результаты вспомогательных экспериментов.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждена соответствующими статистическими характеристиками воспроизводимости экспериментальных данных и независимыми методами анализа. Результаты работы согласуются с известными теоретическими и практическими знаниями по теме диссертации, полученными другими группами исследователей с помощью электрохимических или альтернативных физико-химических и биохимических методов.

Основные положения диссертационной работы были представлены в виде устных докладов и стендовых сообщений на российских и международных конференциях: VII, VIII и IX Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА» (Уфа-Абзаково, 2008, 2012 – грамота за лучший пленарный доклад; Екатеринбург, 2016); VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009 – диплом победителя конкурса молодых ученых); II и IV Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009 – 3-е место международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, 2011); 5-й Международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанобиотехнологии для медицины» (Санкт-Петербург, 2010); I и II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010, 2012 – диплом за лучший стендовый доклад); 5-м Международном симпозиуме по модификации поверхности для химической и биохимической детекции (Лохов, Польша, 2011); 64-м и 65-м Годовом съезде международного электрохимического общества (Сантьяго де Керетаро, Мексика, 2013; Лозанна, Швейцария, 2014); Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013); VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2015); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в комплексном развитии регионов» (Москва, 2016).

Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 40 работ, в том числе 19 статей в научных рецензируемых изданиях: из них 5 в российских и 14 в международных научных журналах, 2 главы в коллективных монографиях, 2 патента и 17 публикаций в материалах конференций. Индекс Хирша автора составляет 11 по данным систем Scopus и Web of Science.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 290 страницах машинописного текста, включает 101 рисунок и 25 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и библиографии, содержащей 360 наименований отечественной и зарубежной литературы.

Диссертация выполнена при поддержке Федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-
технологического комплекса России на 2007–2012 годы»: ГК № 02.512.11.2212 «Разработка
экспериментальной схемы усиления биосенсорного сигнала для количественного
определения биохимических маркеров острой стадии инфаркта миокарда»;

ГК № 16.512.11.2215 «Разработка макетов электрохимических сенсоров для экспресс-диагностики инфаркта миокарда с использованием наноэлектродов»; Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы: ГК № 02.740.11.0306 «Фундаментальные методы протеомного профилирования плазмы крови человека в норме и патологии»; Соглашение о предоставлении гранта в форме субсидии № 8806 «Создание электрохимических биосенсорных систем медицинского назначения»; Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014– 2020 годы»: Соглашение о предоставлении субсидии № 14.604.21.0074 «Разработка электрохимического сенсора патогенной агрегации бета-амилоида при болезни Альцгеймера».