Введение к работе
Актуальность проблемы. Быстрое детектирование микроорганизмов, растительных и животных клеток, а также определение их количества и уровня жизнедеятельности является важной задачей для медицинской практики и биотехнологии. Особого внимания заслуживает проблема быстрого детектирования патогенных микроорганизмов при распространении эпидемий, в том числе с появлением угрозы биологического терроризма. Опасность представляют некультивируемые, латентные формы патогенных микроорганизмов, которые способны восстанавливаться и переходить в активное состояние в организме хозяина. Например, покоящиеся клетки Mycobacterium tuberculosis, которые являются, как полагают многие авторы, причиной латентного туберкулеза, до сих пор не были изолированы из тканей хозяина, так как их количество в инфицированных органах или тканях, может быть крайне мало.
Немаловажной проблемой для медицинской практики остается проблема первичного скрининга антибактериальных препаратов, в том числе действующих на покоящиеся формы патогенных микроорганизмов. Для биотехнологии актуальна проблема быстрого селективного анализа малых концентраций химически агрессивных токсичных соединений.
Для решения этих проблем требуются простые и доступные экспресс методы. Таковыми являются электрохимические методы анализа, основанные на уникальном свойстве живых клеток, содержащих интактную электронтранспортную цепь (ЭТЦ), обмениваться электронами с электродом в присутствии или отсутствии редокс медиаторов. В связи с этим, была сформулирована следующая цель работы.
Цель исследования. Разработать новый вариант амперометрического метода для быстрого определения уровня метаболической активности клеток с целью оценки физиологического состояния клеток при переходе в покоящееся состояние и при воздействии антибиотиков, а также для количественного анализа химически агрессивных соединений с использованием микробных биосенсоров.
Были поставлены следующие задачи:
Найти оптимальные условия для наиболее эффективного проведения электрохимического анализа метаболической активности бактерий, позволяющие сохранить интактность клеток в течение всего эксперимента.
Исследовать динамику перехода Mycobacterium smegmatis в стационарную фазу и покоящееся состояние, используя параллельно методы: электрохимический метод, подсчет колоний, измерение оптической плотности, измерение интенсивности дыхания клеток по поглощению кислорода.
Изучить действие противотуберкулезного антибиотика рифампицина на метаболическую активность и колониеобразующую способность М. smegmatis при введении на разных стадиях роста.
Установить различия механизмов реакции переноса электронов с компонентов ЭТЦ клеток на электрод в присутствии редокс медиатора для прокариотических и эукариотических клеток.
5. Разработать макеты электрохимического биосенсора для определения малых
концентраций химически агрессивного соединения формальдегида с использованием пермеабилизованных и интактных дрожжевых клеток Hansenula polymorpha.
Научная новизна работы. В настоящей работе был впервые разработан новый вариант амперометрического метода анализа клеток, отличающийся универсальностью, простотой исполнения и позволяющий сохранять интактность клеток в течение анализа. Показано, что при прямом контакте прокариотических клеток с электродом происходит перенос электронов с молекул редокс медиатора, находящихся в цитоплазматической мембране на свободно диффундирующие молекулы медиатора в гидрофильной зоне, без выхода молекул медиатора из ЦПМ, и далее на электрод. Для эукариотических клеток перенос электронов происходит только в присутствии гидрофобного медиатора, который пронизывает все структуры клетки и осуществляет перенос электронов с молекул редокс медиатора во внутренней мембране митохондрий, на свободно диффундирующие молекулы медиатора в гидрофильной зоне и далее, преодолевая границы фаз, на электрод. Разработанным электрохимическим методом впервые определена удельная метаболическая активность покоящихся форм бактерий М. smegmatis, культивируемых в неблагоприятных условиях, которая оказалась в 15 - 20 раз ниже активности клеток ранней стационарной фазы, культивируемых в благоприятных условиях. Показано, что рифампицин (10 мМ) оказывает бактериостатическое действие на бактерии М. smegmatis, культивируемые в благоприятных условиях. Культура сохраняет метаболическую активность на достаточно высоком уровне при полном ингибировании колониеобразующей способности.
Практическая значимость работы. В настоящей работе продемонстрирована возможность использования нового варианта амперометрического метода для оценки уровня метаболической активности клеток по величине установившегося стационарного тока, генерируемого клетками на электроде в присутствии редокс медиатора, а также для оценки количества клеток, в том числе покоящихся. Предлагаемый метод является универсальным и может быть использован для исследования большинства живых клеток (бактериальных, грибных, растительных и животных; аэробов и анаэробов), а также тканей и клеточных мембран, сохранивших цепь электронного переноса. Особый интерес, в частности для медицинской практики, представляет использование этого метода для исследования действия антибиотиков на активные и покоящиеся клетки с целью первичного скрининга антибактериальных препаратов.
Сконструированы макеты биосенсоров с использованием иммобилизованных пермеабилизованных и интактных дрожжевых клеток Н. polymorpha для селективного и чувствительного анализа малых концентраций токсичного соединения, формальдегида.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих конференциях: XVIIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Florence, Italy, 2003), 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), XVIIIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Coimbra, Portugal, 2005).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 печатные работы, в числе которых 1 статья в российском и 3 в зарубежных научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения
результатов, выводов и списка цитируемой литературы (214 наименований). Работа изложена на 105 страницах и содержит 22 рисунка и 9 таблиц.
