Электронодонорные свойства ортофосфата и синтез АТР в модельных системах Гончарова, Наталья Владимировна

Введение к работе

Постановка проблемы и ее актуальность. Использование модельных систем - один из методов научного познания, который позволяет исследовать сущность явления в более простых условиях. В настоящей работе модельные системы были использованы для исследования механизма фотофосфорилирования.

Работа была начата в 1963 г. в Лаборатории профессора В.Б.Евстигнеева. В эти годы модельные системы с хлорофиллом в работах А.А.Красновского и В.Б.Евстигнеева были очень успешно использованы для выяснения механизма действия фотохимических реакционных центров растений и бактерий. Была окончательно подтверждена способность хлорофилла и его аналогов к фотосенсибилизации переноса электрона от высокоиотенциаль-ного донора к низкопотенциальному акцептору электронов за счет энергии света и были выявлены с помощью низкотемпературной спектрофотометрии и спектроскопии Э11Р короткоживущие одноэлектронно окисленная и восстановленная формы хлорофилла, катион- и анион-радикалы.

Фотофосфорилироваїше в хлоропластах было открыто Д.Арноном в 1954 г., и к 1963 г. уже были известны основные характеристики процесса (обзор: jagendorf,1962): фотофосфорилирование зависит от света и сопровождается транспортом электронов; для получения больших скоростей образования АТР необходим экзогенный электронный акцептор; процесс мало зависит от температуры и происходит с заметной скоростью при температуре 5С и ниже; в хлоропластах имеется два фосфорилирующих участка -один в области донорной части фотосистемы П и другой в цепи электронного транспорта между фотосистемой П и фотосистемой I.

Зависимость фотофосфорилирования от света и относительно слабая чувствительность к понижению температуры являются

признаками фотохимической реакции, поэтому возникло предположение, что модельные системы с хлорофиллом могут быть использованы для исследования механизма фотофосфорилирования, но каким образом должна работать такая система, было совершенно неясно.

Существуют три основных гипотезы для объяснения механизма мембранного фосфорилирования, включающего окислительное фос-

форилирование в митохондриях и фотофосфорилирование в хлоропластах: химическая (Slater, 1953), конформационная (воуег_г 1964, 1977) и хемкосмотическая (Mitchell, 1961, 1985). Однако ни одна из этих гипотез не объясняет всех известных экспериментальных фактов, в том числе слабую зависимость фотофосфорилирования от понижения температуры. (Воуег,1993)

В настоящее время принято считатьУ"что АТР в мембранном фосформировании образуется при участии мембранной Н⁺-АТРазы в результате информационных изменений, происходящих под действием протон-движущей силы, состоящей из трансмембранного электрического потенциала и/или градиента рН. Вместе с тем, в последнее время известно, что мембранные потенциалы прежде Есего необходимы для нормального функционирования клеток и субклеточных органелл и поддержание их на постоянном уровне ЬГ^-АТРазами сопровождается потреблением готового ATP (Serrano, 1989).

В связи с этим нельзя исключить предположение, что часть АТР синтезируется в цепи электронного транспорта независимо от Н⁺-АТРазы. Поэтому вопрос о связи транспорта электронов с механизмом образования АТР является вполне актуальным.

Именно этот вопрос составил сущность предложенных нами модельных систем, которые были сделаны на основании исследования фотофосфорилирования на фрагментах хроматофоров и хроматофорах фотосинтезирующей бактерии Chromatium minutiesimum. Наиболее тщательно были изучены модельные системы с хлорофиллом, фотосенсибилизирующим перенос электрона от ионов орто-фосфата, предшествующий образованию АТР. Впервые М.Кальвин в 1962 г. высказал предположение об участии хлорофилла в фотофосфорилировании. Предложенный им механизм был выдержан в рамках химической гипотезы сопряжения и казался маловероятным. Однако идея о том, что хлорофилл реакционного центра, например фотосистемы П, может принимать участие в фотофосфорилировании, по нашему мнению была правильной, так как она отражала непосредственное участие фотохимических реакций в фотофосфорилировании.

Целью настоящего исследования являлось выяснение механизма фотофосфорилирования с помощью модельных систем. Мы считали

необходимым исследовать возможный механизм взаимодействия ортофосфата с хлорофиллом, в результате которого могло бы произойти образование АТР. Для этого предполагалось сначала использовать модельные системы с минимальным числом компонентов , а затем проверить на хлоропластах, используется ли такой механизм в фстофосфорилировании. На примере хлорофилла можно было бы понять возможный механизм образования АЇР в цепи электронного транспорта и составить представление о механизме образования АТР в различных фосфорилирующих участках.

Методические аспекты работы. Разрабатывая методические подходы для осуществления данной работы, мы опирались прежде всего на опыт, накопленный в исследованиях по фотохимии хлорофилла в лабораториях В.Б.Евстигнеева, А.А.Красновского, Л.П.Каталина и В.Е.Холмогорова. Однако, для того чтобы понять, каким образом образование АТР может быть связано со способностью хлорофилла фотосенсибилизировать перенос электрона от высокопотенциального донора электронов к низкопотенциальному акцептору, первые опыты были проведены на фотосинтезирующих бактериях. Были использованы пурпурные серобактерии Chromatium minu-tieeimura ИЗ КОЛЛЄК-

ции Е.Н.Кондратьевой на Кафедре микробиологии МГУ.

Фотоскнтезирующие бактерии имеют только одну фотосистему. Фотосистема пурпурных серобактерий аналогична фотосистеме П хлоропластов, где участие хлорофилла реакционного центра в фотофосфорилировании могло быть наиболее вероятным. Кроме того, фотосистема пурпурных серобактерий представляет наиболее простую природную систему, способную к фотофосфорилированию. Здесь фотофосфорилирование не сопровождается выделением кислорода, и так кай эти бактерии являются строгими анаэробами, они не имеют электронтранспортной цепи для окислительного фосфорилирования. Относительная простота организации бактериальной фотосистемы позволила нам сделать предположение, что ионы ортофосфата в фотофосфорилировании являются донорами электрона для хлорофилла реакционного центра.

Для подтверждения способности ионов ортофосфата окисляться до анион-радикала и в результате окисления образовывать соединения с пирофосфатной связью был использован электролиз растворов фосфата калия, где наряду с перфосфатами было показано образование пирофосфата из общего предшественника, которым является

анион-радикал ортофосфата. Чтобы подтвердить способность хлорофилла реагировать с ортофосфатными ионами, как донорами электрона, были проведены многочисленные опыты с хлорофиллом, выделенным по стандартной методике из сухих листьев крапивы, в модельных системах. Были использованы спиртовые растворы хлорофилла и ад-сороаты хлорофилла на окиси алюминия и окиси кремния, применяемых для хроматографии, в водной среде.

Фотосенскбилизированный хлорофиллом транспорт электронов от ионов ортофосфата исследовали спектрофотометрически по восстановлению акцептора электронов - метилового красного и в отсутствие акцептора электронов по фотофеофитинизации хлорофилла в спиртовых растворах, не содержащих кислорода воздуха. Спектрофотометричес-ким методом но изменению спектра поглощения в синей области исследовали образование комплекса между ортофосфатом и атомом магния хлорофилла. Образование анион-радикалов ортофосфата регистрировали с помощью спектроскопии ЭПР. Образование продуктов фосфо-рилирования (пирофосфата, АТР, аргининфосфата) определяли колориметрическим методом по убыли в реакционной среде неорганического фосфата и изотопным методом по включению в образующиеся продукты

Р. Кроме того, образование АТР определяли биолюминесцентным методом и количественным методом бумажной хроматографии. Качественная хроматография на бумаге была использована для идентификации пирофосфата и аргининфосфата.

После того как выдвинутое нами предположение о возможности взаимодействия хлорофилла с ионами ортофосфата как донорами электрона было подтверждено на модельных системах, были проведены многочисленные опыты на хлоропластах высших растений, которые позволили обнаружить целый ряд новых фактов в механизме функционирования фотосистемы II. В этих опытах мы опирались на работы лабораторий Л.А.Блюменфельда, А.Б.Рубина, Г.Г.Комиссарова, Н.В.Карапетяна, В.В.Климова, А.В.Котельниковой, Д.И.Сапожникова, В.А.Чеснокова, О.А.Заленского и др.

Спектрофотометрически по восстановлению феррицианида было показано, что транспорт электронов через фотосистему П зависит от эндогенного ортофосфата. Для того чтобы получить хлоропласты без эндогенного ортофосфата, растения выдерживали на ярком

свету при температуре около І0С в небольшой климатической камере, которая специально для этих опытов была собрана в мастерских Института химической физики РАН и Института биохимии им.А.Н.Баха РАН.

С помощью спектроскопии ЭПР было показано необратимое повреждение реакционных центров фотосистемы П и І в результате уменьшения концентрации эндогенного ортофосфата в хлоропластах. На хлоропластах без эндогенного ортофосфата был зарегистрирован катион-радикал хлорофилла реакционного центра фотосистемы П Р680⁺. Кроме того, на хлоропластах с нормальным содержанием эндогенного фосфата бил записан спектр ЭПР фосфатного анион-радикала, образующегося после освещения при 77 К в фотосистеме П в результате реакции с Р680⁺.

Импульсный свет и амперометрический метод высокой чувствительности для.определения выделения кислорода на отдельные вспышки света были использованы для того, чтобы проследить судьбу гидроксильных радикалов, образующихся в результате синтеза АТР. Тонкослойная хроматография и жидкостная хроматография высокого давления подтвердили участие в этом процессе каротиноидов.

Основная часть работы была выполнена в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН непосредственно автором диссертации. Кроме того, некоторые измерения были сделаны при участии других исследователей. Определение выхода фосфорилирования изотопным методом с Р были сделаны М.Г.Гольдфельдом и Л.Г.Дмитровским в Институте химической физики РАН. Определение концентрации реакционных центров фотосистемы I и фотосистемы П методом ЭПР было проведено А.Г.Четвериковым в Институте физиологии растений РАН. Спектры ЭПР были записаны В.И.Бинюковым в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН и в лаборатории М.К.Пулатовой в Институте химической физики РАН. Определение кислорода при импульсном освещении хлоропластов было сделано Г.А.Птицыным в Институте химической физики РАН. Измерение концентрацій! каротиноидов методом жидкостной хроматографии высокого давления были сделаны Е.В.Пакшиной в Институте биохимии им.А.Н.Баха РАИ. В опытах с импульсным светом была использована установка с импульсной шаровой лампой ИСШ-400, собранная А.Н.Тихоновым на Кафедре биофизики Физического факультета МГУ. В некоторых

опытах были использованы мутаНТЫ СЫшпуаотопаи reihardii» полученные В.Г.Ладыгиным в Институте почвоведения и фотосин-

теза глп.

Научная новизна работы. В настоящем исследовании была предложена новая гипотеза образования АТР из АДР к неорганк-ческого фосфата, согласно которой ион фосфата непосредственно участвует в транспорте электронов и может отдавать электрон хлорофиллу или другим акцепторам электрона. Образующийся в результате одноэлектронного переноса анион-радикал ортофосфата превращается в короткоживущий метафосфат-ион, фосфорилирувдий аденозинфосфаты. Эта гипотеза впервые была сформулирована нами в I969-I97I гг. в работах, проведенных совместно с В.Б.Евстигнеевым. Она находилась в согласии с работой Б.И.Су-хорукова и соавторов (1966) по электронодонорным свойствам ионов ортофосфата и была затем подтверждена в работах других исследователей (С.С.Хрипко, А.А.Ясников, 1976; А.А.Ясников, 1982, 1986; М.П.Колесников и др., 1979; Z.B.Masinoveky, 1984; С.М.Зубкова, 1984).

В опытах на различных модельных системах было экспериментально подтверждено свойство оргофосфат-ионов после окисления до анион-радикала распадаться с образованием мономерного мета-фосфат-иона, который обнаруживается по появлению фосфорили-рованных продуктов, имеющих связи Р-О-Р в пирофосфате и адено-зинфосфатах и связи P-tf в аргинин- и креатинфосфатах.

В различных модельных системах с хлорофиллом в водно-спиртовых растворах и с адсорбатами хлорофилла в водной среде впервые показана способность хлорофилла фотосенсибилизировать образование АТР через взаимодействие с ионами ортофосфата как донорами электрона. Впервые показана способность пероксидазы в присутствии перекиси водорода и аскорбата и одной пероксидазы синтезировать АТР, а также подтверждена обнаруженная ранее (С.Е.Манойлов, 1967, 1971) способность каталазы в простой реакционной системе, содержащей перекись водорода, к образованию АТР.

В опытах с хлоропластами выявлена зависимость базального транспорта электронов в фотосистеме II от эндогенного ортофос-

фата, обнаружено появление катион-радикала Р680⁺, наряду с катион-радикалом Р700⁺, в отсутствие эндогенного ортофосфата. В хлоропластах с нормальным содержанием ортофосфата записан спектр ЭПР фосфатного анион-радикала, образующегося в фотосистеме II после освещения при 77 К, аналогичный спектру ЭПР анион-радикала ортофосфата, зарегистрированному в водно-спиртовых растворах хлорофилла а.

В опытах с импульсным светом подтверждена способность хло-ропластов образовывать АТР на каждую вспышку света, начиная с первой (М.Г.Гольдфельд и др., 1978), а также подтверждена способность каротиноидов принимать участие в выделении кислорода (Д.И.Сапожников, 1965, 1973). На основании этих опытов предложена новая гипотеза выделения кислорода при фотосинтезе, согласно которой выделение кислорода происходит из гидроксиль-ных радикалов, отделяющихся от анион-радикалов ортофосфата при образовании АТР в донорной части фотосистемы П, в кислород-выделяющем комплексе при участии каротиноидов.

Научная и практическая значимость. Настоящее исследование относится к фундаментальным разделам биологии, и оно прежде всего имеет теоретическое значение для выяснения механизма фотосинтеза и для понимания формирования биоэнергетических процессов в ходе предбиологической эволюции.

Кроме того, обнаруженная в опытах на хлоропластах растений с разным содержанием эндогенного ортофосфата зависимость проницаемости мембран хлоропласта для ортофосфата от температуры среды, характеризующаяся плохой проницаемостью у культурных растений при температуре ниже 15С, могла бы быть использована в селекции для получения холодоустойчивых сортов для выращивания в северных районах страны.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Втором Всесоюзном биохимическом съезде (Ташкент,1969), на Всесоюзных конференциях по фотосинтезу в Путино в 1970,1989 и 1993 гг., на Всесоюзных конференциях по проблемам мембранной биоэнергетики (Москва,1974; Пущино,1991), на ХП Международном ботаническом конгрессе (Ленинград,1975), на Первом Всесоюзном биофпзи-

ческом съезде (їпосква, 1982), на Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности" (Львов,1984), ка заседании Бессоюзного биохимического общества (Москва, 1982). на IX Международной конференции по происхождении жизни (Прага, 1989), на заседании Всесоюзного ботанического общества, посвященном намята профессора Д.И.Сапожкккова (Санкт-Петербург, 1991), на Международной конференции "Моделирование первичных стадий фотосинтеза", посвященной памяти профессора В.Б.ЕвстигнееБа (Пущине , 1993), а также на конференциях - конкурсах Института биохимии им.А.Н.Баха РАН в 1974, 1975, 1989, 1991 и 1992 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ : 24 статьи и II тезисов докладов на всесоюзных и международных конференциях.

Обьен и структура работы. Диссертация изложена на 282 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 57 рисунков и список цитированной литературы, состоящий из 478 отечественных и иностранных публикаций.

Работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной часта, изложенной в трех главах, заключения и выводов. Введение "Краткая предыстория вопроса и задачи настоящего исследования" и небольшой литературный обзор "Основные свойства фото-фосфорилирования" даот литературно-теоретическое обоснование диссертационной работы. В экспериментальной части представлены результаты, их обсуждение и дано краткое описание использованных методов. В первой главе "Разработка рабочей гипотезы" представлены опыты на бесклеточных препаратах и хроматофорах из фотосин-тезирующбй пурпурной серобактерии Chromatium minutiseimum , которые показали, что фотофосфорилирующая активность сохраняется у фрагментов хроматофоров, полученных в результате длительной обработки ультразвуком, несмотря на потерю цитохромов, и связано скорее всего с пигментной системой, а также то, что образование АТР сопровождается незамкнутым транспортом электронов на феназин-метосульфат, экзогенный акцептор электронов, и зависит от наличия ортофосфата. Предположение о том, что ионы ортофосфата могут быть донорами электрона подтверждено результатами, полученными в опытах по электролизу. На основании этих данных, а также на осно-

вании анализа химических свойств ортофосфата по литературным данным в конце ятой главн сформулировяня рабочая гшіотяяя. согласно которой центральное место в образовании АТР занимает анион-радикал ортофосфата, образующийся в результате непосредствен-

ii(YPn vTjgc^njr О^ТО^-С^ЗТ—HQHOB В ТрЗНСПОрте ЭД2КТрОКН.

Вторая глава "Ортофосфат-ионы как доноры электрона при образовании AT? в модельних системах" содержит данные, подтверзда*>-щие способность ионов ортофосфата реагировать с хлорофиллом на свету, отдавая ему электрон, и превращаться в метафосфат, фосфо-рилирующий различные соединения. В этой главе представлены опнтн с хлорофиллом в водно-спиртовых растворах и в адсорбированном состоянии, а также модельные системы, где в качестве акцептора электронов по отношении к ионам ортофосфата выступают активные формы кислорода - синглетлый кислород в опытах с каталазой и гидроксильные радикалы в опытах с пероксидазой. В конце главь рассматривается значение втих работ для понимания закономерностей становления биохимических процессов в предбиологической эволюции.

В третьей экспериментальной главе "Роль фосфат-ионов в транспорте электронов и механизм фотофосфорилироваиия в хлоропластах высших растений" представлены данные, говорящие о том, что в донорной части фотосистемы П может функционировать такой же механизм образования АТР, как и в модельных системах с хлорофиллом, при этом гидроксильные радикалы, отделяющиеся от ортофосфата, могли бы служить субстратом для выделения кислорода.

В разделах "Заключение" и "Выводы" подведены основные итоги работы.

Фотофоофорилированне на бесклеточных препаратах и хроматофорах фРТОСИНТезирующеЙ бактерии Chromatlum mlnutiaal аиш. Одним из условий успешной работы на биологических препаратах является получение активного материала, который с хорошей скоростью катализирует изучаемую реакцию. Поэтому большое внимание было уделено условиям выращивания бактерий, позволяющих! получать достаточ-

но большое количество биомассы, условиям разрушения бактерий ультразвуком для получения содержащих хроматофори бесклеточнкх препаратов или экстрактов и изолированных хроматофоров, а также условиям проведения ошіїоб по фотофо сформированию. Когда зтн условия были отработаны, и мы стали получать стабильно активные в фотофосфорилировашш бактериальные препараты, была поставлена задача выяснить, сохраняется ли фотофо<^рядярукщая активность при разрушении хроматофоров фотосинтезирующих бактерий на более мелкие частацы и каков возможней минимальный размер частиц, сохраняющих способность к фотофосфорилированио. Мы исходили из предположения, что образование АТР происходит при участии хлорофилла реакционного центра, и поэтому размер пигментированных частиц не должен был иметь существенного значения.

Для разрушения хроматофоров был использован наиболее простой метод - продолжительная обработка (до 15 мин) ультразвуком в ультразвуковом дезинтеграторе MsE-500 Вт (20 килогерц). Полученные фрагменты фракционировали с помощью сульфата аммония, и затем сульфат аммония отделяли от пигментированных частиц гельфиль-трацией на сефадексе G-25. Все операции проводили при 4.

Было показано (Гончарова, Евстигнеев, 1972), что число пигментированных фракций возрастает при увеличении продолжительности ультразвуковой обработки, составляя после двух минут - две, после 5 мин - три, после 10 мин - пять и после 15 мин - шесть. После 15 мин озвучивания первая фракция осаждается в растворе сернокислого аммония со степенью насыщения 0,3, вторая - 0,4 и т.д. и последняя - 0,8. Фракции хроматофоров и их фрагментов нумеровали по мере осаждения. Фракции I и 2 содержали неразрушенные хромагофоры, выход фракций 5 и 6, содержащих наиболее мелкие фрагменты был очень небольшим. После осаждения последней фракции окрашенных частиц остается прозрачный бледно-розовый раствор, содержащий различные белки, в том числе цитохромы.

Неразрушенные хроматофори (фракции 1-2) содержат значительное количество цитохромов, составляющее 0,05 мкмоль на I мкмоль бактериохлорофилла, однако все полученные нами фрагменты в своем составе цитохромов не содержали. На основании этих данных можно было считать, что разрушение хроматофоров путем озвучивания сопровождается переходом большей части цитохромов в раствор, для

- II -

того чтобы оценить размер полученных нами фрагментов, было проведено ориентировочное определение коэффициента седиментации наиболее мелких фрагментов, Седиментаиионнне диаграммы показали, что наиболее мелкие фрагменты хроматофоров имеют коэффициенты седиментации равные 90 и 120 s. Так как коэффициенты седиментации определялись в довольно разбавленном растворе (0,3% белка), можно допустить, что соответствующие константы седиментации имеют примерно такие не значения. По данным Дя.Берг.ерона (1962) хроматофори Chromatium имеют молекулярную массу 13 млн и константу седиментации 143 з . Сравнивая полученные коэффициенты седиментации с константой седиментации хроматофоров, можно видеть, что наиболее мелкие фрагменты по величине меньше хроматофоров. С другой стороны, они во много раз превышают хлорофилл-белковый комплекс, выделенный из зеленых серобактерий (j.M.Olson , 1966) и имеющий константу седиментации 7 s , а также реакционные центры, выделенные ИЗ Bhodopseudomonao viridis (н.Michel, J. Deisenhofer » 1986). Полученные нами фрагменты представляют, по-видимому, сложные ли-попротеидные структуры значительной величины.

Определение фотофосфорилирующей активности в присутствии экзогенного переносчика электронов - феназинметосульфата показало, что при увеличении продолжительности озвучивания скорость фото-фосфорюшрования в бесклеточных бактериальных экстрактах, содержащих хроматофори и хроматофорные фрагменты, значительно падает, составляя.после 5 мин озвучивания 312 мкмоль фиксированного неорганического фосфата на I мг бактериохлорофилла в час, после 10 мин - III и после 15 мин - 80. Скорость фотофосфорилирования у хроматофоров и фрагментов составляет 60-40$ от скорости, наблюдаемой у бесклеточных экстрактов. Помимо потери активности, происходящей во время озвучивания, значительная инактивация фотофосфорилирующей системы как у фрагментов, так и у неразрушенных хроматофоров происходит в процессе фракционирования сульфатом аммония. Частично инактивация может быть следствием недостаточно полного удаления сернокислого аммония, являющегося ингибитором

ДЛЯ фотофосфорилирования (D.W.Krogmann et al. , 1959). Фото-фосфорилирующая активность у фрагментов всегда ниже, чем у хроматофоров, и падает при уменьшении их размера. Однако падение активности у фрагментов по сравнению с хроматофорами значительно

меньше, чем падение активности у неразрушенных хроматофоров в процессе фракционирования. Все фрагменты хроматофоров, полученные путем озвучивания сохраняют способность к фотофосфорилированию. Эти данные свидетельствовали о том, что образование АТР может бить связано с пигментной системой.

В процессе работы по фракционированию хроматофоров имея дело с большиы количеством препаратов с разной фотофосфорилирующей активностью, мы обратили внимание на то, что экзогенный переносчик электронов - фсназинметосудьфат, используемый для опытов по фотофосфорилированию, с разной скоростью превращается в пиоцианин в зависимости от фотофосфорилирующей активности препарата. Превращение феназинметосульфата в пиоцианин было исследовано более подробно (Н.В.Гончарова, В.Б.Евстигнеев, 1971). Феназинмето-сульфат и пиоцианин имеют разные максимумы в спектре поглощения (w.s.zaugg , 1964), и за превращением феназинметосульфата в пиоцианин легко наблюдать как визуально, так и с помощью спектрофотометра. Пиоцианин является первым продуктом в ряду ОКИСЛИСЯ 1,11

0,11

-ОМ

-0,13

-0,11

Рис.1. Влияние состава реакционной среды на окисление феназинметосульфата (ФМС) в пиоцианин

при освещении, а - дифференциальные спектры "свет - темнота"

(освещение 10 мин); б - ход окисления ФМС в пиоцианин при разном

составе реакционной среды.

1. - 0,3 мМ раствор ФМС в 0,1 М трис-НС1-буфере, рН 7,8;

2. - ФМС + экстракт ch. minutiesinium (0,08 мг Бхл/мл);

3. - то же, что 2, с 6,6 мМ фосфатом калия,рН 7,8, 3,3 мМ АДР и 3,3 мМ MgCigJ 4 - то же, что 2, с фосфатом калия.

- ІЗ -

тельной фотодеструкции феназшшетосульфата под действием белого света в присутствии кислорода воздуха. Оказалось, что в водных растворах феназинметосульфат при освещении белым светом в присутствии кислорода воздуха окисляется в гагацнанин практически полностью в течение 10 мин. Точно также происходит окисление фе-назинметосульфата в пиоцианин, если к водному раствору феназин-метосульфата в трис-буфере добавить хроматофори. Однако если вместе с хроматофорами добавляется Р_н и /ДР окисление феназинме-тосульфата значительно замедляется, при этом достаточно одного ортофосфата, чтобы уменьшить окисление феказинметосульфата за 10 мин в два раза (рис.і').

Ка основании этих опытов мы пришли к выводу, что транспорт электронов на феназинметосульфат в этой системе зависит от ортофосфата, который и является донором электронов. Отдавал электрон, ион ортофосфата превращается в анпон-радикзл, который распадается с образованием радикала 'ОН и метафосфат-иона, фосфорилирующе-го аденозинфосфаты.

Образование пирофосфата при электролизе водных растворов ортофосфата калия. Наиболее простой способ подтвердить способность ионов ортофосфата быть донорами электрона и показать возможность образования пирофосфатных связей как следствие превращения иона ортофосфата в анионтраддкал - это исследовать продукты электролиза. Опыты по электролизу растворов ортофосфата в основном проводились в 20-ые годы ( p.Fichter.et ai.» 1918; 1919; 1928; S.Ниsain, J.H.Partington , 1928; I, I.Creaser, J.0.Edwards , 1972). В этих работах было установлено, что выделяющийся на аноде атомарный кислород в щелочной среде окисляет ионы ортофосфата до анион-радикалов, которые затем превращаются в диперфосфат

НО. .0 Ох .ОН НО. ^0

^. р<^ \ р / _и щоноперфосфат Р^

"0^{х Х}0- О"" ^0~ ~0^Х ООН

В некоторых работах было отмечено появление пирофосфата ( p.Fich-ter, A.Hlus у Ніго , 1919). Были определены оптимальные условия для электролиза: для образования перфосфатов, как и при получении персульфатов, используют растворы солей калия или аммония и добавляют в электролит фториды и хроматы.

В наших опытах (Н.В.Гончарова, В.Б.Евстигнеев, 1975) мы подтвердили необходимость фторидов и хроматов для синтеза перфосфатов и пирофосфата при электролизе 2 М раствора фосфата калия. В

опытах по зависимости выхода продуктов электролиза от рН в области от 6,0 до 9,5 мы обнаружили, что перфосфатн образуются при всех значениях рН с максимумом в области рН 8,0-9,0, а пи-рофосфат образуется только в области рН 8,0, причем образование пирофосфзта сопровоадается небольшим уменьшением в синтезе ди-и моноперфосфатов, подтверждая то, что юс общим предшественником является фосфатний анион-радикал. Выход пирофосфата яа 2 часа электролиза в расчете на 7 мл электролита составлял примерно 180 мкмоль, что соответствует по содержанию фосфора 2,5^ от общего количества фосфора в растворе электролита.

to рН

Flic.2. Образование перфосфатов и пирофосфата при электролизе 2 М раствора lytPO^ ^в зависимости от рН среды: I - моноперфосфат, 2 -дидерфосфат, 3 - пирофосфат, сила тока 0,1 А (а) и 0,3 А (б).

Синтез перфосфатов показывает, что образование фосфатного анион-радикала возможно в широкой области значений рН в нейтральной и щелочной среде. Синтез пирофосфата имеет экстремальную зависимость от рН, что может свидетельствовать об участии протонов в отрыве ОН-радикала при образовании метафосфат-иона (А.А.Ясняков, 1982): хотя способность фосфата быть донором электронов зависит от степени ионизации и увеличивается с ростом рН, уменьшение в реакционной среде концентрации протонов прекращает образование фосфорилировашшх продуктов. С другой стороны, способность превращаться в метафосфат может быть свойством только двухзарядных ионов и переход ортофосфата в трехзарядный ион при более высоких значениях рН также будет останавливать реакцию. Оптимальное значение рН для образования пирофосфата при электролизе совпадает с оптимальными значениями рН для образования АТР при фотосинтетическом и окислительном фосфорилированин.

Ионы ортофосфата как доноры электрона и предлагаемая рабочая гипотеза. Способность ионов ортофосфата быть донором электрона обычно выпадает из поля зрения исследователей. Однако возможность образования короткоживущих анион-радикалов ортофосфата хорошо обоснована экспериментально. В цикле работ Хайона и соавторов были исследованы спектры поглощения анион-радикалов ортофосфата, имеющие широкий максимум в области 500 нм, при комнатной температуре. Анион-радикалы ортофосфата были получены при импульсном фотолизе в области жесткого ультрафиолета (j.R.Huber, Е.Науоп, 1968) и при импульсном радиолизе водных растворов (е.D.Black, Е.Науоп , 1970; G. Grabner et al. , 1973). Время полужизнп анион-радикалов ортофосфата при комнатной температуре 300 мкс, они являются окислителями и быстро восполняет потерянный электрон, реагируя с веществами, находящимися в растворе, например этанолои,

ГЛЮКОЗОЙ, ПИРИМИДИНОМ И др. ( M.Nafcashima, Е.Науоп , 1970).

Спектры ЭПР анион-радикалов ортофосфата были записаны при

77 К В Кристаллических Образцах ( S. Subramanian et al. , 1970;

W.E.Hughee, W.G.Moulton , 1963; К. Tsuchida et al. , 1975) И

в водных растворах ( I.S.Ginns, м.C.R.Symono , 1975) после облу-

чения рентгеновскими лучами или ^-лучами Со. Анион-радикалы ортофосфата дают дублетные сигналы ЭПР с g-фактором в области 2,00 я сверхтонким расщеплением от 2 до 4 мТл.

Как оказалось, самые различные соединения могут акцептировать электрон от ионов ортофосфата. В работе Б.И.Сухорукова и соавторов (1966) было исследовано взаимодействие ортофосфата, ATP, а также некоторых алкилфосфатов, рибозофосфата, пирофосфата, AMP и АДР с акцепторами электрона, дающими при одноэлектронном восстановлении характерные сигналы ЭПР. В качестве акцепторов электрона были использованы тетрацианэтилен, хлоранил, парабензохинон, метиленовий синий и рибофлавин. Сигнал ЭПР восстановленного акцептора в присутствии ортофосфата наблюдается начиная со значений рН 5 и выше, увеличиваясь при переходе от однозарядного иона к двухзаряд-ному'и от двухзарядного к трехзарядному. Если сравнить окислительно-восстановительные потенциалы некоторых из использованных акцепторов электрона, например парабензохинон E_Q=40,28 В, метиленовий синий Е =+0,01 В, рибофлавин E_Q=-0,2I В, то молено видеть, что фосфат-ионы могут быть окислены соединениями с довольно низким

окислительно-восстановятельным потенциалом.

Помимо одноэлектронного окисления ионов ортофосфата акцептором электронов с образованием фосфатного анион-радикала возможна одновременная атака ионов ортофосфата со стороны донора и акцептора электрона.Такші реакция была предложена в работе С.С.Хрипко и А.А.Ясникова (1976):

^—^ч 9 ,—к 9, ІІР0²-

RS: Н + НО-Р-0" + Ag⁺ —*- ES-Sfi + Н₂0 + Р-О" + Ag S HPgO^"

6" 0 "^

Ион серебра окисляет ортофосфат до анион-радикала, превращаясь в металлическое серебро, и одновременно цистеин восстанавливает отделяющийся гндроксилькый радикал до воды, превращаясь в цистин. Аналогичная реакция известна в химии с трехвалентным железом и молекулярным водородом: в результате реакции образуется пнрофос-фат, двухвалентное железо и вода:

2 FeP0₄ + Н₂ >- Fe₂P₂0₇ + Н₂0

Последние две реакции могут служить модельной системой для фос-форилирования в цепи электронного транспорта, если предположить, что ион ортофосфата встраивается в фосфорилирующем участке между двумя переносчиками электронов, акцептором и донором электронов. Способность анион-радикала ортофосфата превращаться в мета-фосфат-ион, являющийся активным фосфорилирующим агентом, обусло-^ влена электронным Строением фосфатов (D.W.J.Cruickshank , 1961; Я.А.Левин, Е.И.Воркунова, 1978; Д.Корбрида, 1982) и, в частности, свойством атома фосфора образовывать вторую координационную связь за счет пары электронов на второй из четырех вр³-орбиталей. В анион-радикале образование второй координационной связи, по-видимому, может инициироваться кислородным атомом, потерявшим электрон. Одновременно происходит отсоединение гидроксильного радикала и увеличивается взаимодействие между неподеленныии электронами 2р-орбиталей трех оставшихся атомов кислорода и свободными d-орбиталями атома фосфора, образующими систему 3-орбиталей атома фосфора в метафосфат-ионе остается свободной, обусловливая его высокую реакционную способность в реакциях с соединениями, имеющими неподеденные электронные пары, в том числе с гидроксильными ионами.

На основании известных свойств фосфатов, а также наших данных по фотофосфорнлированию у фотосинтезирувдих бактерий и электролизу растворов ортофосфата нами была сформулирована рабочая гипотеза, которая может быть представлена следующей схемой:

-ATP
»w~ ^ *~

ЧО-Р-0- . "⁶" ^ НП*-Х> iLn~ ?-" ^- ^1Ц"⁴ ' НРоО,,³-

J_ 'ЧІ " N. П - О

ы₂о + о₂

Ион ортофосфата окисляется до анион-радикала возбужденным светом хлорофиллом реакционного центра фотосистемы П, бнктериохлорофнл-лом реакционного центра пурпурных фотосиятезируюдих бактерий или переносчиком электронов в фосфорилирующем участке электронтранс-портной цепи. Анион-радикал ортофосфата, теряя гидроксильный радикал, превращается в метафосфат-ион, который присоединяется к АДР с образованием АТР, к ортофосфату, давая пирофосфат, или соединяется с водой, превращаясь снова в ортофосфат. Судьба гнд-роксильных радикалов может быть двоякой. В фосфорилирующем участке, расположенном в донорной части фотосистемы П хлоропластов, гидрокснльные радикалы могут служить субстратом для выделения молекулярного кислорода. Если фосфорнлирующему участку в цепи электронного транспорта предшествует восстановленный переносчик электронов, то гидроксильный радикал восстанавливается до гидро-ксильного иона, например, в хлоропластах на участке образования АТР, расположенном в цепи электронного транспорта между фотосистемой П и І, в хроматофорах фотосинтезирующих бактерий, где гидрокснльные радикалы могут восстанавливаться цитохромами с, получающими электроны от восстановленных соединений серы или органических доноров электрона, и при окислительном фосфорилировании в митохондриях.

Применимость этой схемы для объяснения механизма фотофосфо-рилирования была проверена в опытах на модельных системах, где прежде всего была подтверждена способность хлорофилла реагировать с ионами ортофосфата как донорами электрона.

ОРТОФОСФАТ-ИОНЫ КАК ДОНОРЫ ЭЛЕКТРОНА ПРИ ОБРАЗОВАНИИ АТР В СДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

Перенос электрона от ионов ортофосфата и образование шгро-ФосФата в водно-спиртовых растворах хлорофилла. Спиртовые растворы хлорофилла а представляют наиболее простую систему, в которой можно наблюдать взаимодействие между ионами ортофосфата и молекулой хлорофилла. В этой системе было показано, что хлорофилл фотосенсибилизирует перенос электрона от ионов ортофосфата и это? процесс сопровождается образованкем пирофосфата.

При смешивании концентрированного раствора хлорофилла а в этаноле с концентрированным раствором ортофосфата калия в небольшом количестве воды между ортофосфатом к хлорофиллом образуется комплекс, благодаря которому при добавлении этанола ортофосфат удерживается в растворе. Так как ортофосфат не растворим в спирте в аналогичных растворах без хлорофилла ортофосфат выпадает в осадок. Возможность образования комплекса между атомом магния хлорофилла и атомами кислорода ортофосфата показана методом инфракрасной спектроскопии (j.P.Leicknom et ai., 1974). В наших опытах подтверждением существования такого комплекса мы считали небольшое уменьшение оптической плотности в более длинноволновом из двух максимумов поглощения в синей области спектра в результате прибавления ортофосфата к спиртовому раствору хлорофилла. Ранее в работах В.Б.Евстигнеева и соавторов (1950) было показано, что подобные изменения в спектре поглощения хлорофилла и других магний-порфиринов могут происходить в присутствии молекул, имеющих атомы кислорода и азота с неподеленными электронными парами (например, вода, спирты, молекулярный кислород, амин), и являются результатом образования координационной связи между этими атомами и атомом магния пигмента.

Одним из доказательств взаимодействия хлорофилла с какой-либо молекулой как донором электронов является фотовосстановление пигмента в системе, содержащей два компонента: хлорофилл и молекулы донора электронов. В спиртовых растворах, как было показано ранее ( т.т.Bannister , 1959; А.А.Красновский, Е.В.Пакшина, 1963; Е.В.Пакшина и др., 1967), вместо образования восстановленной формы хлорофилла, наблюдаемого в пиридиновых растворах, происходит феофитинизация пигмента, которая также является следст-

виєм фотосенсибилизированного хлорофиллом переноса электрона от донора электронов. Феофитинизация - замена атома магния з порфн-риновом кольце на атоми водорода - обычно происходит в кислых средах. Фотофеофитинизация также происходит и в шелочной среде. В наших опытах было показано, что фотофеофитинизация при освещении спиртовых растворов хлорофилла а без кислорода воздуха и других акцепторов электрона в нейтральной и плябо-щедочяой среде происходит в присутствии ортофосфата (Н.В.Гончарова, В.Б.Евстигнеев, 1971; Н.В.Гончарова, М.Г.Гольдфельд, IS88). Это подтверждает способность ионов ортофосфата быть донором электронов для хлорофилла.

Другим доказательством транспорта электрона от ионов ортофосфата является фотосенсибнллзировашюе хлорофиллом восстановление

Ряс.З. Зависимость скорости восстановления метилового красного и убыли ортофосфата в водно-спиртовых растворах хлорофилла а при освещении от начального значения рН реакционной смеси.

4. - восстановление метилового красного в присутствии KgHPO^J

5. - убыль фосфата в присутствии метилового красного; 3 - восстановление метилового красного без KgHP0₄; 4 - убыль фосфата без метилового красного. Время освещения 60 мин. В 2 мл реакционной смеси Ю~М хлорофилл а, 6,5.10" Ы К2НР0₄, 2,2.10^- метиловый красный, 2,5$ воды по объему к 96$ спирту.

акцептора электронов - метилового красного (рис. 3). Процесс сопровождается образованием пирофосфата, который как продукт реакции в спиртовых растворах хлорофилла был идентифицирован с помощью бумажной хроматографии. В этой системе восстановление метилового красного происходит только в присутствии ортофосфата, а об-

разование пирофосфата - только в присутствии метилового красного. Оптимальная концентрация воды в этих опитах составляла 2,5$ и скорость образования пирофосфата была примерно 20 мкмоль на I мг хлорофилла в час (Н.В.Гончарова, М.Г.Гольдфельд, 1985). Выход фосфорилирования определяли по убыли ортофосфата в реакционной среде колориметрическим методом ( h.j. l.Aiien , 1940; В.А.Чесно-ков и др., I960). Аналогичные опыты были проведены с кислородом воздуха в качестве акцептора электронов (Н.В.Гончарова, 1981). В этом случае оптимальной оказалась концентрация воды в области 13-20$ и скорость образования пирофосфата в оптимальных условиях была примерно 30 мкмоль на I мг хлорофилла в час. Для сравнения можно отметить, что скорость образования АТР в хлоропластах без экзогенных акцепторов электрона, когда транспорт электронов связан с восстановлением кислорода воздуха, составляет те же величины, а именно 5-40 мкмоль АТР на I мг хлорофилла в час ( M.Avron, j.Neumann _f 1968). Аденозинфосфаты из-за плохой растворимости не могли быть использованы в качестве акцептора метафосфат-иона в водно-спиртовых растворах хлорофилла.

Первым продуктом окисления иона ортофосфата возбужденным светом хлорофиллом является анион-радикал ортофосфата, который при комнатной температуре имеет короткое время жизни. Однако так как эта реакция происходит внутри комплекса ортофосфата и хлорофилла и сопровождается переносом одного электрона, она может происходить в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (77 К), и в этих условиях анион-радикал ортофосфата может быть зарегистрирован методом ЭПР. Для того чтобы исключить сигнал радикала хлорофилла, образующегося в результате присоединения электрона от ортофосфат-иона, опыты проводили в присутствии кислорода воздуха - конечного акцептора электронов, принимающего электрон от хлорофилла (Н.В.Гончарова и др., 1993). Радикалы этилового спирта и парамагнитные молекулы кислорода и их радикалы дают многолинейные сигналы низкой интенсивности, которые плохо видны в спектрах ЭПР (З.П.Грибова и др., 1963; В.Е.Холмогоров и др., 1963; Г.Т.Рихирева и др., 1964; В.Б.Евстигнеев и др., 1971; С.А.Альтшулер, Б.М.Козырев, 1961; Дж.Вертц, Дж.Болтон, 1975; H.Beringer, J.G.Caetle , 1951). Поэтому можно считать,что обнаруженные нами сигналы ЭПР (рис. 4, а и б, с.30) с g-факто-ром в области 2,00 принадлежат анион-радикалу ортофосфата. При

сравнении спектров ЭПР, представленных на рис. 4, а л б, можно видеть, что характерный для радикалов ортофосфзта дублетный сигнал ЭПР С расщеплением ОКОЛО 2 мТл (S.Subramanian et al. , 1970; I.S.Ginns, M.C.R.Symons , 1975) лучше виден при pH 7.6. тогда как пра рН 8,0 он почти полностью переходит в синглетный сигнал, обусловленный, по-видимому, более сильным взаимодействием ортофосфзта с атомом магния хлорофилла в щелочной среде» Шнршш линии синглетного сигнала примерно 1,1 мТл, он легче насыщается при увеличения мощности СМ. Известно, что сииглетннЗ сигнал с

ШЗрШЮЙ ЛИНИИ ОКОЛО 1,2 МТЛ имеет MgHPO^.SHgO ( S.Subramanian et al. , 1970).

. ФотоФосфорилпрованке, катализируемое хлорофилло.м в адсорбированном состоянии. Применение адсорбатов позволяет работать с хлорофиллом в водной среде к использовать в качестве акцептора метафосфат-иона аденозинфосфаты. Первые опыты были сделаны с адсорбатами фотослнтетических пигментов на окиси алюминия А^Од, используемой для хроматографии. Ранее в работах В.Б.Евстигнеева и В.А.Гавриловой (I960) и Г.Г.Комиссарова и соавторов (1964) было показано, что адсорбаты хлорофилла, феофитина и /3-каротина фотосенсибилизируют реакции переноса электрона от донора электронов, например, аскорбиновой кислоты, к акцептору - метиловому красному. В наших опнтах (Н.В.Гончарова и В.Б.Евстигнеев, 1977) мы использовали хлорофилл а, хлорофилл в, хлорофиллы а+в, феофи-тины а+в и /3-каротин для фотосенсибилизации образования АТР в присутствии кислорода воздуха как конечного акцептора электронов. Полученные результаты представлены в таблице.

Таблица. Образование АТР, фотосенснбилизированное фотосинтетическими пигментами, адсорбированными на AlgOg

П**" мклюЯт^нГіТпигмента РН - оптимум

в час

Хлорофиллы а+в 3,2 7,6

Хлорофилл а 5,4 7,6

Хлорофилл в 2,0 7,6

Феофитины а+в 4,8 7,2 и 7,8

/3 -Каротин 0,8 7,5

Выход реакции определяли по убыли ортофосфата в реакционной смеси и по фосфорилированип аденозинфосфатов, которые были измерены методом бумажной хроматографии (А.В.Котелышкова и др., 1959; W.E.Cohn, C.E.Carter , 1950).

Адсорбаты хлорюфиллов а+в на хроматографической окиси кремния (силохроы C-I20) были использованы в опытах по разделению световой и темновой стадий. Выход реакции определяла радиоактив-

- ор -

ным методом по включению ортофосфата, содержащего Р во вновь образующиеся фосфорклирован.чые продукты (Н.В.Гончарова и др., IS80). Было показано, что достаточно осветить адсорбат с хлорофиллом в виде сухого порошка или с небольшим количеством воды и сразу после выключения света в темноте добавить Р_н и АДР или один Р_н, чтобы произошло образование АТР или пирофосфата. Процесс обусловлен образованием на свету короткоживущего катион-радшсал-ла хлорофилла в результате переноса электрона от фотовозбужденного состояния пигмента на кислород воздуха, который силохром, как и другие адсорбенты, прочно удерживает на своей поверхности в непосредственной близости от хлорофилла. Исключение из реакционной смеси кислорода путем откачивания воздуха из сосуда значительно снижает выход фосфорилирования. Однако полностью процесс не останавливается, так как сравнительно мягкими методами (кратковременная откачка без нагревания) полностью удалить адсорбированный на силохроме молекулярный кислород не удается. Данные по разделению световой и темновой стадий фосфорилирования, полученные в этих опытах, также подтверждают представление о том, что хлорофилл может непосредственно участвовать в фотофосфорили-рованни, и энергия поглощенного им света используется для активации ортофосфата.

В опытах с адсорбатами хлорофиллов а+в на силохроме с полной реакционной смесью было показано, что помимо фосфорилирования аденозинфосфатов и образования пирофосфата, возможно образование аргининфосфата из аргинина, а также то, что конкурентный донор электронов - аскорбат натрия ингибирует фосфорилирование, препятствуя реакции ортофосфат-ионов с хлорофиллом.

Фосфорилирование аденозинфосфатов при кислотно-основном переходе в модельной системе, содержащей адсорбированный хлорофилл. Адсорбаты хлорофиллов а+в на окиси алюминия были использованы в опытах по образованию АТР в результате кислотно-основ-

ного перехода (Н.В.Гончарова, В.Б.Евстигнеев, 1977). Впервые

А.Т.Ягендорф И Э.УраЙб (A.T.Jagenflorf, "К. Uribe , 1966) сообщили о том, что если погрузить хлоропласти сначала в кислую среду, имеющую рН около 4,0, и затем перенести их в щелочную среду с рН 8,0, содержащую в своем составе АДР и ортофосфат, то происходит темновое образование АТР, которое авторы объяснили с точки

Зрения ХЄМИОСМОТИЧЄСКОЙ ГйПОТЄЗН П.МаТЧела ( P.Mitchell- I96T,

1966). Однако в связи с тем, что мембраны хлоропласта содержат ряд фотосинтетических пигментов в большой концентрации, з том числе хлорофилл, вероятным на наш взгляд представлялось также предположение, что в результате перемещения хлоропластов из кислой в щелочную среду происходит активация хлорофилла, благодаря которой последний приобретает способность принимать электрон от иона ортофосфата, тем более, что было обнаружено ( в.с.маупе, R.Clayton , 1966), что после перемещения кз кислой в щелочную среду хлоропласти испускают свет хемилюминесценции. Подобная хе-милюминесценция наблюдалась также после прибавления к изолированным хлоропластам восстановителя, дигионита.

В наших опытах реакционная смесь, содержащая адсорбаты, Р_н и АДР скачала делалась кислей, рН 4,0, а затем щелочной, рН 7,8-8,4. Необходимая кислотность в реакционной среде создавалась с помощью НзР0₄, чтобы не усложнять систему введением дополнительных компонентов. Необходимое значение рН в щелочной среде создавали с помощью КОН. Фосфорилирование аденозинфосфатов определяли с помощью хроматографии на бумаге. Наибольшее образование АТР было получено при рН 8,0-8,2 в щелочной среде и составило примерно 0,30 мкмоль на I мг хлорофилла. Такой же выход был получен на адсорбатах, содержащих только хлорофилл а или только хлорофилл в. Однако в опытах с адсорбатамя феофитина а+в образование АТР не было обнаружено.

Исследование спектров поглощения хлорофилла а в условиях кислотно-основного перехода показало, что синтез АТР в щелочной среде сопровождается образованием феофитина. Таким образом, в кислой среде происходит активация хлорофилла, связанная с его способностью превращаться в феофитин, например взаимодействие ионов водорода с атомами азота порфиринового кольца, а в щелочной среде.процесс феофитинизации завершается выходом атома магния в результате переноса электронов от ионов ортофосфата, следствием которого также является образование АТР.

Следует отметить, что в хлоропластах в результате кислотно-основного перехода может происходить активация и других центров, способных акцептировать электрон от ионов ортофосфата. Например, было показано (Л.А.Блюменфельд и др., 1987; Л.А.Блюменфельд, А.Н.Тихонов, 1987), что изолированный фактор сопряжения, выделенный из хлоропластов или из митохондрий, после кислотно-основного перехода приобретает способность синтезировать АТР. Возможно, образование АТР в этом случае связано с восстановлением дисульфидных связей в молекуле белка.

Образование АТР в модельных системах при участии каталазн и пероксидазы. Как пример других, отличных от хлорофилла, акцепторов электрона от ортофосфат-ионов были использованы активные формы кислорода, образующиеся при разложении перекиси водорода в присутствии каталазн к пероксидазы.

При разложении перекиси водорода каталазой образуется вода и молекулярный кислород, который поданным М.Анбара (м.АпЪаг , 1966) и М.Каши и А.У.Кана (м.Kasha, А.и.Khan , 1970) находится в синглетном возбужденном состоянии. Благодаря взаимодействию синглетного кислорода с ионами ортофосфата происходит образование АТР из АДР и Р_н. Выход реакции в простой системе, содержащей каталазу, перекись водорода, ортофосфат калия и АДР при рН 8,0 в наших опытах составил 150 мкмоль АТР на I мг каталазн в час (Н.В.Гончарова, В.Б.Евстигнеев, 1975). Впервые убыль неорганического фосфата и синтез АТР в модельной системе, содержащей каталазу, KvjOg, АДР, ортофосфат, глюкозу и гексокиназу при рН 7,0 были показаны в работе С.К.Манойлова и соавторов (1971). С.М.Зубкова (1984) и Х.Жоуве и соавторы (H.Jouve et al., 1988) также подтвердили способность изолированной каталазн синтезировать АТР.

Основная функция пероксидаз в биологических системах - это окисление с помощью К>)02 органических соединений, например, полифенолов и некоторых ароматических аминов. В модельных системах, содержащих пероксидазы, в качестве восстановителя для перекиси водорода используют аскорбат. Было показано ( P.George, D.H.Irvine , 1956; K.G.Paul , 1963), что в результате этой реакции, помимо гидроксилов воды, образуется сильный окислитель - гидроксильные радикалы. В наших опытах мы использовали систему пероксидаза-аскорбат-Е^ как продуцента гидроксильных ради-

калов для окисления ионов ортофосфата (Н.В.Гончарова и др., 1980). Скорость образования ЛТР в реакционной смеси, содержащей пероксидазу, аскорбат, 1^0^, ортофосфат калия и АДР при рН 7,5 составляет примерно 120 нмоль на I мгпероксндазн в час. Фосфо-рилирование определяли по вклачецкю ^м? в образующиеся продукти. Образование АТР не происходило в отсутствие пероксидазы и в том случае, когда реакционная смесь содержала пероксидазу и аскорбат без 1^2 или пероксидазу и J^Og без аскорбата. В полной реакционной смеси цкаккд натрия икгкбировал образование АТР. Следует отметить, что пероксидаза без аскорбата з К^О^ образует АТР нз АДР и Р_н со скоростью примерно 80 нмоль на I мг пероксидазы в час. Так как фосфорйлйрованне не происходят в присутствии одно-гойонора электронов - аскорбата или одного акцептора электронов — перекиси водорода, можно предполагать, что пероксидаза реагирует с иоиами ортофосфата одновременно и как с донором, я как с акцептором электрона; в результате реакции образуется метафос-фат-ион, фосфорилирующий аденозинфосфаты, и гидроксильный ион. Наряду с аденозинфосфатами в этих опытах были использованы и другие потенциальные акцепторы метафосфат-иона, например аргинин и креатин. Скорость образования аргининфосфата и крезтинфос-фата при рН 7,5 составляет, соответственно, примерно 18 и 12 нмоль на I мг пероксидазы в час, а скорость образования пирофос-фата в реакционной среде без АДР и других акцепторов - примерно 6 нмоль на I мг пероксидазы в час.

Модельные системы как путь для понимания закономерностей становления биохимических процессов в предбиологической эволюции. Опыты на простых модельных системах могут быть полезны для понимания процессов предбиологической эволюции (С.Э.Шноль,1979; М.Г. Гольдфельд, Н.В.Гончарова,1989; Goncharova.Goldfeld, 1990). Одна из проблем предбиологической эволюции - это образование в водной среде дегидратирующих агентов, необходимых для синтеза полипептидов и полинуклеотидов из соответствующих мономеров. Наиболее широко в биологических системах в реакциях дегидратации используются пирофосфатные связи. Поэтому фосфорилирование, происходящее в результате фотосенсибилизированного переноса электрона в водной среде при участии магний-порфиринов в адсорбированном состоянии, как было показано нами на примере хлорофилла, или при участии гемопротеиноидов, как было показано в опытах М.П.Колес-

никова и соавторов (1979), а также в темноте в результате перо-ксидазной активности гемощгатеиноидов (z. Masinovsky , 1984) представляет возможные пути образования пирофосфатных связей, которые могли быть использованы в условиях предбиологической эволюции.

РОЛЬ ФОСФАТ-ИОНОВ В ТРАНСПОРТЕ ЭЛЕКТРОНОВ И МЕХАНИЗМ ФОГОФОСШРИЯИРОВАШЯ В ХЛОРОПЛАСТАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Зависимость транспорта электронов в хлоропластах от ионов ортофосфата. После того как было выяснено, что в модельных системах ионы ортофосфата реагируют с хлорофиллом как доноры електрона и реакция завершается образованием пирофосфата или АТР, нами было показано, что транспорт электронов в фотосистеме П зависит от ионов ортофосфата и "базальний" транспорт электронов отсутствует, если в хлоропластах нет эндогенного ортофосфата. Хлоропласти, обычно используемые в опытах, содержат примерно I мкмоль Р_н на I мг хлорофилла. В наших опытах хлоропласти без эндогенного ортофосфата или с его незначительным содержанием - менее 10 нмоль на I мг хлорофилла получали из листьев растений, которые предварительно в течение примерно двух часов выдерживали на искусственном свету высокой интенсивности или на солнце (100 тыс. лк) при температуре 10. В этих условиях потребление неорганического ортофосфата в первичных реакциях фотосинтеза не компенсируется его поступлением из проводящих систем, что приводит к значительному уменьшению уровня эндогенного ортофосфата в хлоропластах.

Транспорт электронов в хлоропластах наблюдали спектрофото-метрическим методом по восстановлению феррицианида при освещении реакционной смеси. В хлоропластах без эндогенного ортофосфата восстановление феррицианида не происходит. Однако процесс может быть возобновлен при добавлении в реакционную среду с хлоропластами ортофосфата или специфического донора электронов для фотосистемы П - дифенилкарбазида.

Хлоропласти, лишенные эндогенного ортофосфата, исключительно быстро теряют активность при хранении и освещении. Например, если освещать хлоропласти в отсутствие Р_н в течение 5 мин, то дальнейшее добавление Р_и уже не приводит к активации транспорта

электронов. Хранение при 0 в темноте в отсутствие Р„ приводят к инактивации способности к транспорту электронов и нечувствительности к добавлению Р_н уже через 2,5 час, тогда как препараты, полученные по такой же методике, но с нормальным содержанием эндогенного Р_ц, сохраняют активность более двух суток. Инактивация хлоропластов без эндогенного ортофосфата происходит в результате необратимого окисления пигментной системы из-за отсутствия эндогенного донора электронов, которыми могут быть ионы ортофосфата.

Повреждение реакционных центров фотосистемы П и I при недостатке ортофосфата. Концентрацию реакционных центров фотосистемы I и П измеряли в листьях, чтобы избежать повреждения реакционных центров при выделении хлоропластов, по интегральной интенсивности сигналов ЭПР I и П, принадлежащих катион-радикалу Р700⁺ в фотосистеме I и кислород-выделящему комплексу фотосистемы П, соответственно (А.Г.Четвериков, 1983). Собранные листья сразу фиксировали жидким азотом, и измерения спектров ЭПР проводили при 77 К при постоянном освещении. Было показано (Н.В.Гончарова и др., 1990), что в процессе освещения растений в течение 5 часов при температуре ЮС происходит уменьшение концентрации эндогенного ортофосфата в хлоропластах от I мкмоль до менее, чем 10 нмоль на I мг хлорофилла. Одновременно необратимо уменьшается концентрация реакционных центров, причем в первую очередь фотосистемы П и затем фотосистемы I, уменьшается общее количество хлорофилла и увеличивается количество светособирающего хлорофилла в расчете на один реакционный центр. Такие изменения в пигментной системе могут свидетельствовать о донорной функции ионов ортофосфата в фотосистеме П, так как действие света на реакционные центры фотосистемы П в отсутствие донора электронов должно вызывать их необратимое окисление, а отсутствие потока электронов от фотосистемы П к фотосистеме 1,в свою очередь, приводит к необратимому окислению реакционных центров фотосистемы I. Повреждение реакционных центров прекращает сток световой энергии с обслуживающего их светособирающего хлорофилла, что приводит частично к его выцветанию, а также, возможно, к перераспределению на другие еще работающие

реакционные центры.

Аналогичные результаты были получены на диком штамме Chlamy-domonae reinhardii и мутантах, содержащих только фотосистему I или фотосистему П. Было показано, что реакционные центры фотосистемы I в мутанте, имеющем только фотосистему I, значительно более устойчивы к действию света при пониженной температуре, чем реакционные центры фотосистемы П в мутанте, имеющем только фотосистему П. В диком штамме, как и в высших растениях, в первую очередь повреждаются реакционные центры фотосистемы П, затем фотосистемы I.

Образование катион-радикала Р680+ при недостатке эндогенного ортофосфата в хлоропластах. Было показано (Н.В.Гончарова и др., 1991), что при недостатке ортофосфата в фотосистеме П накапливается катион-радикал хлорофилла реакционного центра Р680⁺, образующийся в результате происходящего под действием света переноса электрона от F680 к первичному акцептору электронов tt. Катион-радикал Р680⁺ был обнаружен в спектрах ЭПР хлоропластов по изменению параметров и кривой СВЧ-насыщения сигнала ЭПР I, который в хлоропластах с нормальным содержанием эндогенного ортофосфата обусловлен сигналом катион-радикала хлорофилла реакционного центра фотосистемы I Р700⁺. Появление сигнала Р680⁺ увеличивает амплитуду и ширину сигнала ЭПР I, а кривая СВЧ-насыщения, показывающая зависимость интенсивности сигнала ЭПР I от мощности СВЧ, становится более выпуклой. Препараты для измерения спектров ЭПР хранили в жидком азоте при 77 К, при этой же температуре после кратковременного освещения (10 с) регистрировали спектры ЭПР. Если к хлоропластам, содержащим Р680⁺, добавить перед замораживанием доноры электронов - ортофосфат или дифенилкарбазид, иди ингибитор диурон (3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина), который, присоединяясь к первичному акцептору электронов Q, прекращает транспорт электронов через фотосистему П (j.barergne ,1982), то сигнал Р680⁺ в спектрах ЭПР исчезает и сигнал ЭПР I вновь приобретает параметры, характерные для сигнала Р700⁺: амплитуда и ширина сигнала 310 I уменьшаются, а кривая СВЧ-насыщения становится менее выпуклой. В разностных спектрах ЭПР "хлоропласты без эндогенного ортофосфата-минус-те же хлоропласты с ортофосфа-том или с дифеиилкарбазидом, или с диуроном" обнаружен синглет-тый сигнал катион-радикала Р680⁺. Спектры ЭПР выравнивали по по-

ложешго минимальной точки между сигналами ЭПР II и І в низкополь-ной области спектра.

Образование фосфатного анион-радикала при освещении хлоро-

nnar"Pr\~a rmw 77 ТГ Т?г»птг и ота ттопплтглчгонтіо г» тглы мжл тглиі? лт»чі*-і__

**"" *" * ^-" ** t-"* ' * _И *« * -<-»V*4*4 *.AL*UJ^ *4./w/V4<-fr*.4SJl*0»4*4W V 4UII1 9 » * V *4<_Г141.Я \^ ^/ *. ЧЛ ~

фосфата являются эндогенными донорами электрона для Р680, правильно, то можно ожидать, что в результате реакции хлорофилла

*uw v nvJnamn v^ilaj/vUvJjcvaci Kjuyaaj&kbn ijruv/i»ainnri алиил-pcw'"^*¹-'»

(Н.В.Гончарова и др., 1993). Эта реакция должна происходить при температуре жидкого азота, так как F680 восстанавливается эндогенным донором электронов в этих условиях. Следует отметить, что попытки найти донор электронов для Р680⁺ делались неоднократно. Однако радикалы окисленного эндогенного донора электронов определялись только при комнатной температуре, хотя и в короткие промежутки времени. Эти условия измерения позволяют обнаружить только более поздние стадии переноса электрона в донорной части фотосистемы П. Например, при комнатной температуре были обнаружены изменения в спектре ЭНР хлоропластов в области сигнала ЭПР П, получившие название сигнал n_f И II^_f (R.E.Blankenship et al., I975;^p-J.O'Malley, G.Babcockl984), а также зарегистрирован радикал тиразина (C.Gerken et ai.,1988). Изменения степени окисления двухвалентного марганца, входящего в состав кислород-внделяющего комплекса, в ответ на коротіте вспышки света определяли при комнатной температуре (T.Wydrzynaki,K.Sailer,1980) И при криогенных

температурах, но после освещения при комнатной температуре (G.Dismukes,Y.Siderei^I98I). В некоторых опытах освещение проводили при температуре 190 К, затем образцы нагревали в течение 30 мин до 0 и после этого снова замораживали до 77 К для регистрации образовавшихся радикалов (j.c.ie Paula et al. ,1985).

В настоящей работе спектры ЭПР хлоропластов регистрировали при 77 К сразу после освещения при этой же температуре. Дублетный сигнал анион-радикала ортофосфата с g-фактором 2,00 и расщеплением примерно 2 мТл был обнаружен нами в разностном спектре ЭПР "хлоропласты-минус-те же хлоропласти с диуроном" (рис. 4, в к г). Разностный спектр позволяет устранить сигналы ЭПР от радикалов, возникающих после освещения в акцепторной части фотосистемы П, а также в фотосистеме I. Диурон, останавливая транспорт электронов через фотосистему П, препятствует окислению эндогенного донора электронов. Сигнал ЭПР анион-радикала ортофос-

- зо -

Aw\_s

_л

wv/W

/KPV/V"

I .-I

J_ J * і І і

-N^VV

wvW|

^*r*ftjb/w*Ji^ Ithm-brfhfrfjfoAj

fOc-iT/l

I и

fl.VO

J I I i_i l 1 1_

5мТг

5-/,00 I "*

I I I f I I I I

- ЗІ -

Рис. 4. Спектры ЭПР водно-спиртовых растворов хлорофилла а с 0,01 М фосфатом калия (а и б) и хлорошшстов (в и г)

~<п.» ПГ] ТГ „„ , _л,*„„,„„,.., —

пут tt l\. uuu;jc иызъщ&ишг »

a - при pH 7,6 и мощности СВЧ-поля 5 мВт. б - при рН 8,0 и мощности СВЧ-поля 10 мВт (I), 50 мВт (2), 100 мВт (3). Амплитуда ВЧ-модуляцим 0,5 мТл; концентрация хлорофилла 3 мг/мл.

в - при рН 7,5; I - контрольные хлоропласти, 2 ~ хлороиласты с диуроном (ЮМ), 3 - разностный спектр Э11Р "хлоропласты-минус-хлоропласты с диуроном", 4 - то же, что 3, но при четырехкратном усилении. Мощность СВЧ-поля 5 мВт, амплитуда ВЧ-модуляции 0,2 мТл.

г - то же, что "в", 4, при рН 8,0. Мощность СВЧ-поля 10 мВт (I), 150 мВт (2) и 100 мВт (3); амплитуда ВЧ-модуляции 0,5 мТл. Концентрация хлорофилла в хлоропластах 4,5 мг/мл.

фата, наблюдаемый в хлоропластах, но своим свойствам аналогичен сигналу анион-радикала ортофосфата в спиртовом растворе хлорофилла а (рис. 4, а и б).

Концентрацию хлороплзстов выравнивали по сигналу ЭПР П, принадлежащему кислород-выделяющему комплексу, параметры которого не изменяются при низкой температуре. В связи с этим, чтобы сохранить хлоропласти максимально кативными, образцы для измерения спектров ЗПР готовили при 4; слабый свет во время замораживания хлорошшстов жидким азотом способствовал заполнению небольшого пула акцепторов электрона в фотосистеме II до места действия диурона.

Влияние эндогенного ортофосфата на спектры поглощения хлоро-пластов. Были измерены спектры поглощения хлоропластов, содержащих разное количество эндогенного ортофосфата - I мкмоль и менее 10 нмоль на I мг хлорофилла (Н.В.Гончарова, М.Г.Гольдфельд,1988). Было показано, что оптическая плотность в более длинноволновом из двух максимумов поглощения в синей области спектра при 435 нм в хлоропластах без эндогенного ортофосфата или с его низким содержанием выше, чем в хлоропластах с нормальным содержанием ортофосфата. При освещении хлоропластов с нормальным содержанием

эндогенного ортофосфата в реакционной среде, способствующей ег потреблению в фотофосфорилировании, т.е. в присутствии акцепто электронов - метилвиологена и акцептора мзтафосфат-кона - арг кина, также происходит увеличение оптической плотности при 435: Этот процесс наблюдается в первые примерно 10 мин освещения, затем оптическая плотность падает кз-за обесцвечивания пигмнн*' ной системы. Возможность участия аргинина и образования аргиниі фосфата в фотофосфорйлировании на хлоропластах было показано в наших опытах с ³²Р (Н.В.Гончарова, М.Г.Гольдфельд, 1983). Аргинин был использован в опытах, так как в отличие от аденозинфос-фатов он не может быть потенциальным источником Р_ц. В предварительных опытах было обнаружено, что при недостатке в хлоропластах ортофосфата аденозннфосфаты гидролизуются и количество орте фосфата увеличивается, по-видимому, в результате действия АТРа: и аденилаткиназы.

Данные по увеличению оптической плотности при 435 нм в результате потребления эндогенного ортофосфата свидетельствуют о разрушении комплекса между ортофосфатом и атомом магния хлорофилла, который, по-видимому, образуется в хлоропластах так же, как и в спиртовых растворах хлорофилла. В образовании комплекса с ортофосфатом в хлоропластах принимает участие не только хлоре филл реакционного центра фотосистемы П, но и часть светособираг щего хлорофилла, так как увеличение оптической плотности при 435 нм продолжается в течение нескольких минут. Это увеличение ускоряется в присутствии разобщителей - метиламина и хлористого аммония и отсутствует, если в реакционную смесь включается инги битор транспорта электронов в фотосистеме П - диурон.

Механизм образования АТР и судьба гидроксильных радикалов в фотосистеме П. Для того чтобы проследить судьбу гидроксильных радикалов, образующихся в результате фосфорилирования в до-норной части фотосистемы П, был использован импульсный свет с частотой I Гц (одна вспышка в секунду), и одновременно на кажду вспышку света определяли образование АТР, изменения в составе каротиноидов и выделение кислорода (Н.В.Гончарова и др., 1993). В этих опытах, как и ранее в работе М.Г.Гольдфельда и соавторов (1978), было показано, что образование АТР происходит на каждую

вспьшіку света, начиная с первой. Продолжительность светового импульса от импульсной шаровой лампы ИШ-400, измеряемая на уровне 505 от его амплитуда составляла 15 ?лкс. Такая длительность вспышки обеспечивает одноразовое возбуждение реакционных центров (H.T.Witt , 1971). Поэтому полученные результаты по образованию АТР подтвердили, что этот процесс является однозлектроннык ;: вместе с тем они свидетельствовали о том, что на каждую вспышку СЕета в фотосистеме II одновременно с АТР из фосфатного анпон-ра-дикала должен образовываться гидроксяльный радикал. Дальнейшая судьба гидроксилышх радикалов, по нашему мнению, должна быть связана с выделением кислорода, которое может представлять один из возможных путей их обезвреживания. Каротиноиды как природные антиокскданты могли бы принять участке з этом процессе, тем более что причастность каротиноидов, в том числе виолаксантииа, к выделению кислорода была показана в работах Д.И.Сапожликова и соавторов (Д.И.Сапожников, 1965; D. I. Sapozhnlkov , 1973).

Состав каротиноидов в темновом контроле и после освещения зтдельными вспышками света, следовавшими с частотой I Гц, определяли методом тонкослойной хроматографии и методом жидкостной хроматографии высокого давления. Было обнаружено, что лютеин , /3-каротин и виолаксантин - основные каротиноиды, которые претерпевают периодические изменения при освещении импульсным светом. Для того чтобы подтвердить участие каротиноидов в выделении кислорода были использованы хлоропласти с нормальным содержанием виолаксантииа и хлоропласти, обогащенные виолаксантином в результате выдерживания растений перед выделением хлоропластов в тече-аие суток в темноте.

Было показано, что в хлоропластах, обогащенных виолаксанти-аом, выделение кислорода происходит уже на первую вспышку света, тогда как в хлоропластах с нормальным содержанием виолаксантииа кислород выделяется практически только на третью вспышку. В нормальных хлоропластах на первую вспышку света происходит образование виолаксантииа из лютеина. Одновременно образуется ^5-каротин. Гак как эти каротиноиды принадлежат к разным гомологическим рядам ( T.W.Goodwin, 1980; В.Н.Карнаухов, 1988), их взаимопревращения могут происходить только внутри комплекса, образуемого атомами переходного металла, лигандами в котором должны быть все

группы атомов участвующих в этом процессе каротиноидов. Можно предполагать, что каротиноиди входят в состав кислорол-выделяюще: комплекса вместе с ионами марганца, тем более что ранее (Д,И.Сапожников, О.Д.Сахарова, 1964) было показано, что взаимопревращения каротиноидов в хлоропластах на свету происходят только при наличии ионов марганца.

В диссертации представлена теоретически возможная схема циклических взаимопревращений каротиноидов в кислород-выделяющем комплексе, содержащем ионы марганца, с периодом в 4 вспышки в результате взаимодействия с гидроксильными радикалами. Показаны превращения /3-каротина, лютеина и виолаксантина, однако в аналогичных реакциях могли бы участвовать и все остальные каро-тиноиды.

а.

_I-

Рис. 5. Образование АТР и выделение кислорода в фотосистеме П.

На рис. 5 показана общая схема предлагаемой гипотезы. Ион ортофосфата отдает электрон хлорофиллу реакционного центра фотосистемы П Р680, и образующийся фосфатный анион-радикал распадаетс с образованием метафосфат-иона и тидроксильного радикала. Последний попадает в систему выделения кислорода. Метафосфат- ион присоединяется к АДР, давая АТР, или реагирует с водой, давая исходный ортофосфат. В результате взаимодействия метафосфат-иона с водой кислород воды входит в ортофосфат. Это подтверждается данными М.Аврона и соавторов (M.Avron et ai., 1965), которые показали, что 0 из воды попадает в ортофосфат и в АТР. Согласно схеме, вода в фотосинтезе окисляется с помощью ортофосфата.

Участие фосфата в качестве посредника при окислении воды может объяснить состав кислорода, выделяющегося при фотосинтезе.

Как известно, в выделяющийся кислород, помиг-га кислорода воды, может входить кислород углекислого газа и ортофосфата. Если в хлоропластах не происходит фиксации углекислого газа, как например В ОИЫТах Р.Рэдмера И О.ОллИНГера (R. Radmer, O.Ollinger,

1980), которые освещали хлоропласгы в среде, содержащей экзогенный акцептор электронов - ферркцизкид и разобщитель - метиламин, т.е. в условиях, когда не происходило ни фиксации С0₂, ни фото-фосфорилирования, весь выделяющийся кислород принадлежал кислороду воды. Если происходит фиксация углекислого газа и синтез углеводов, как например в опытах Метцнера и соавторов ( н. Metzner et ^al- , 1979) на одноклеточной зеленой водоросли Ankiatrodesmuв braunii , один из кислородных атомов СОр, присоединившегося к рибулозодифосфату, в последующих реакциях отрывается с помощью концевой метафосфатной группы АТР. В результате атом кислорода из (Х>2 оказывается в составе ортофосфата и затем выделяется как кислород фотосинтеза. Количество кислорода из ортофосфата (Е.Ру и др., 1961) невелико, что скорее всего обусловлено тем, что небольшое количество молекул ортофосфата постоянно участвует в биохимических превращениях и в их состав попадает кислород воды и органических соединений.

В последние годы были достигнуты большие успехи в выделении изолированных реакционных центров фотосистемы П и выяснении их структуры (обзор: E.j.Debu8, 1992). Однако препараты изолированных реакционных центров фотосистемы П, в отличие от модельных систем с хлорофиллом, не могут быть использованы в опытах по исследованию электронодонорных свойств фосфата. В присутствии детергентов, которые необходимы для получения этих препаратов, обнаружить фотофосфорилирование и участие фосфатных ионов в транспорте электронов довольно трудно, так как детергенты обладают разобщающим действием и могут присоединяться к атомам магния молекул хлорофилла, мешая реакции последних с фосфатными ионами.

Механизм образования АТР во втором фосфорилирующем участке хлоропластов. Второй фосфорилирующий участок хлоропластов находится в цепи электронного транспорта между фотосистемой П и фотосистемой I на уровне комплекса цитохромов b₆-f. Механизм

образования ATP в этом участке должен быть таким же, как и в фосфорилирующих участках в окислительном фосфорилировании. Поэтому зависимость транспорта электронов от неорганического фосфата и образование АТР били исследованы на изолированной митохон-дриальной цитохромоксидазе, которая была использована как одна из возмоздкх модельных систем (Н.В.Гончарова. 1993).

Опыты, проведенные на полученных нами препаратах цитохромок-сидазы, выделенной по методу Б.Эрреде и соавторов (в.Еггейе et в 1978), показали, что изолированная цитохромоксидаза после удалеї сульфата аммония, используемого для ее выделения и очистки, мож< катализировать образование АТР, взаимодействуя с ионами фосфата как с донорами электронов. Однако в диссертационной работе эти опыты не рассматриваются, так как вопрос о том, используется ли такой механизм в фосфорилирующих участках окислительного фосфор] лирования in vivo требует более тщательных и разносторонних исследований.

ВЫВОДЫ

1. На хроматофорах и хроматофорных фрагментах из фотосинте-зирующей Пурпурной серобактерии Chromatium minutissimum установлено, что фотофосфорилирование связано с пигментной сио темой и сопровождается незамкнутым потоком электронов, который зависит от ортофосфата.

2. Показано, что продуктами окисления фосфата при электроли зе являются моно- и диперфосфаты и пирофосфат. Общим предшественником этих соединений является фосфатный анион-радикал.

3. Сформулирована рабочая гипотеза, согласно которой ключевым соединением в синтезе АТР в фотофосфорилировании является анион-радикал ортофосфата. Последний распадается с образованием метафосфат-иона, фосфорилирующего АДР до АТР, и гидроксильного радикала, судьба которого может быть различной в разных фосфори лирующих участках.

4. Установлено в модельных системах, что фосфат реагирует на свету с хлорофиллом как донор электронов. Процесс сопровожда ется образованием пирофосфата в спиртовых растворах хлорофилла и АТР в водных растворах„ содержащих адсорбаты хлорофилла на

хроматографической окиси алюминия или окиси кремния.

5. Показано образование ЛТР в модельной системе, содержащей каталазу, перекись водорода, АДР и ортофосфат, и образование АТР, аргининфосфата, креатинфосфата и иирофосфата в модельной системе, содержащей пероксидазу, перекись водорода, аскорбат, ортофосфат и соответствующий акцептор метафосфат-иона.

6. Установлено на основании изучения зависимости транспорта электронов через фотосистему П хлоронластов от эндогенного фосфата и исследования спектров ЭПР хлоропластов при температуре 77 К, что хлорофилл реакционного центра фотосистемы П Р600 может реагировать с неорганическим фосфатом как с донором электронов.

7. Показано при импульсном режиме освещения, что образование АТР в хлоропластах происходит на каждую вспышку света. Одновременно происходят изменения в составе каротиноидов, которые коррелируют с выделением кислорода.