Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола Тихонова Анастасия Геннадьевна

Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола
<
Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Тихонова Анастасия Геннадьевна. Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.04 / Тихонова Анастасия Геннадьевна; [Место защиты: Гематол. науч. центр РАМН].- Москва, 2010.- 105 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-3/287

Введение к работе

Актуальность проблемы

Более 35 лет назад было показано, что эритроциты как носители могут успешно использоваться в клинической практике. Это возможно потому, что данные клетки отличаются некоторыми уникальными преимуществами по сравнению с другими системами доставки лекарств. Эритроциты являются не только натуральными, безопасными и доступными в препаративном количестве, но и способны к биодеградации, длительно циркулируют в крови (в среднем 120 дней [Гайтон А.К. и др. 2008]), снижают аллергические и иммунологические реакции на введение белковых препаратов в кровь. Существует ряд направлений в использовании эритроцитов-переносчиков, одно из которых состоит в том, что клетки рассматриваются не как пассивные переносчики, а как биореакторы. Это подразумевает под собой «включение» ферментов, которые в ряде случаев не содержатся в нативных эритроцитах, и благодаря тому, что субстраты и продукты реакций, катализируемых данными ферментами, достаточно хорошо проходят через мембрану эритроцита. Такие носители могли бы эффективно перерабатывать токсическое вещество непосредственно в кровотоке. Идея использовать эритроциты в качестве биореакторов была высказана около 30 лет назад [Adriaenssens К., et al. 1976; Updike S.J., et al. 1976; Ihler S.J., et al. 1976] и доведена до применения в клинической практике на примере ряда ферментов (L-аспарагиназа, аденозиндеаминаза) [Kravtzoff R., et al. 1996; Вах В.Е., et al. 2007]. В эритроциты был «включен» целый ряд ферментов, которые были предложены для терапии таких болезней и состояний как: острый лимфобластный лейкоз, лимфосаркома, подагра, болезнь Гоше, гипераммониемия, интоксикация метанолом и др. Результаты ряда работ подтверждают, что нагруженные ферментами эритроциты удаляют из кровеносного русла токсические и повышенные концентрации различных соединений, таких как метанол и формальдегид при отравлении метанолом [Magnani М., et al. 1993], глюкоза при диабете [Rossi L., et al. 1992].

Эритроциты-биореакторы для снижения в крови концентрации этанола и ацетальдегида - главного токсического продукта метаболизма спирта, были предложены около 10 лет назад. С этой целью в эритроциты были «включены» два фермента: алкогольдегидрогеназа и альдегиддегидрогеназа. К сожалению, данная разработка как и многие другие не используются в клинике в настоящее время. Мы полагаем, что проблема может заключаться в неэффективной скорости работы биореакторов. В данной работе были изучены возможные причины, ограничивающие высокую скорость биореактора на примере окисления этанола.

Цель работы.

Целью работы было выяснение причин ограничивающих скорость окисления этилового спирта эритроцитами-биореакторами в условиях in vitro и преодоление этих ограничений с целью увеличения скорости окисления спирта в ацетат.

Задачи исследования

  1. Исследование зависимости эффективности работы ферментов (алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы) от их количества и от доступности субстратов (пирувата, НАД , НАДН).

  2. Выбор оптимальных условий для «включения» максимального количества ферментов в эритроциты.

  3. Изучение влияния процедуры «загрузки» ферментов на функциональную полноценность клеток.

  4. Оценка стабильности «включенных» в эритроциты ферментов в процессе хранения.

Научная новизна

В результате работы были выяснены причины, ограничивающие высокую эффективность эритроцитов-биореакторов по окислению этанола, и найдены способы их преодоления. Были разработаны методы, позволяющие эффективно включать белки с достаточно большим молекулярным весом и получать «нагруженные» эритроциты близкие по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными эритроцитами. Был произведен сравнительный анализ биореакторов, полученных различными методами по следующим характеристикам: определение осмотической резистентности эритроцитов, распределение нагруженных эритроцитов по плотностям, измерение эритроцитарных индексов. Было показано, что метод одноступенчатого гипоосмотического диализа является предпочтительным по сравнению с двух- и трехступенчатым как по проценту «включения» ферментов, так и по жизнеспособности эритроцитов. Изучение эритроцитов во время хранения показало, что в течение 7 суток не происходит значительного снижения активности «включенных» в эритроциты ферментов.

Практическая ценность работы

Полученные результаты важны для понимания причин, которые ограничивают скорость не только окисления этанола, но и иных субстратов в случае создания других эритроцитов-биореакторов, В данной работе было показано, что скорость работы эритроцитов-биореакторов по окислению этанола и ацетальдегида можно многократно

увеличить, в 45 и более раз. Такое увеличение эффективности может, например, улучшить терапию пациентов при отсутствии митохондриальной формы альдегиддегидрогеназы с низким значением константы Михаэлиса или при алкогольной интоксикации, зачастую сопровождающейся алкогольной болезнью печени.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Одним из ограничителей эффективной работы биореактора по окислению этанола является пируват, поступление которого только за счет гликолиза недостаточно. В его присутствии скорость увеличивается в 17 раз.

  2. Вторым ограничителем служит пул НАД и НАДН, добавление которых при диализе позволяет восстановить их близкие к исходным концентрации в эритроцитах, увеличивая эффективность работы эритроцитов-биореакторов в 3 раза.

  3. Разработаны методы «включения» алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в эритроциты человека позволяющие получать высокий процент «включения» белков и клетки сходные по биохимическим и биофизическим свойствам с нативными. Оптимальным методом «включения» ферментов является одноступенчатый метод диализа.

  4. При хранении эритроцитов-биореакторов в течение 7 суток происходит снижение активности альдегиддегидрогеназы в 2 раза, тогда как активность алкогольдегидрогеназы снижается незначительно.

Апробация работы состоялась 09.11.2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 «Биохимия, биофизика и реология крови» в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации были представлены на ряде российских и международных научных конференций: IV Московский международный конгресс «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006, Москва, Россия; VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», 23-24 ноября 2006, Москва, Россия; 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия; Gordon Research Conferences «Drug Carriers in Medicine and Biology», 24-29 Aug., 2008, B.S., Montana, USA; Международный форум по нанотехнологиям, 03-05 декабря 2008, Москва, Россия; Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», 06 декабря 2008, Москва, Россия; 14 Европейский

конгресс по биотехнологии «Симбиозис», 13-16 Sep., 2009, Barcelona, Spain.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ из которых, 2 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов в сборниках трудов отечественных и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из следующих основных разделов: введение; литературный обзор (содержит 4 рисунка); постановка задачи (содержит 1 рисунок); материалы и методы; результаты (содержит 20 рисунков и 5 таблиц); обсуждение; выводы и список цитированной литературы - 223 источников из них 6 русскоязычных.

Диссертационная работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН (лаборатория физической биохимии системы крови; заведующий лабораторией д.б.н., профессор Ф.И. Атауллаханов).

Похожие диссертации на Эритроциты как носители ферментов для окисления этанола