Введение к работе
Актуальность проблемы. Казеиновая киназа типа 2 (СК-2) является характерным ферментом всех изученных типов клеток эукариот. Анализ первичной структуры субьединиц фермента, выделенного из разных источников от дрожжей до человека [Saxena et at.. 1987, Chen Wu et al.. 1988, Meisner et at.. 1989. Dobrowolska et at.. 1991, Mandor et al., 1991, Jedlicki et at., 1992,] окончательно подтвердил представления об уникальности и консервативности СК-2; позволил обосновать некоторые эмпирические свойства СК-2, в частности, РНК-связывающую активность фермента (Ни and Rubin, 1990, Gatica et at.,1994). Именно белки, также обладающие РНК-связывающей активностью (ферменты и белковые факторы, осуществляющие и контролирующие экспрессию генома эукариот), составляют главную группу субстратов СК-2. Участие в контроле процессов, связанных с функционированием нуклеиновых кислот, по-видимому, является основной функцией СК-2.
Установлено, что изменение активности СК-2 сопряжено "С любыми изменениями физиологического состояния клеток, будь то трансформация, дифференцировка, рост или пролиферация клеток [Krebs et al.,1988, Berberich and Cole.,1992, Pepperkok et al.,1994, Gruppuso et al., 1995]. Однако, отсутствие явных вторичных мессенджеров для СК-2, широкая субстратная специфичность фермента [Pinna. 1990, Allende et al., 1995) значительно усложняет анализ процессов активации - ингибирования СК-2 in vivo. Возможно, наблюдаемые изменения активности CIC-2 являются следствием перераспределения фермента между различными клеточными структурами Действительно, иммуноцитохимическими методами было показано, что действие некоторых гормонов вызывает обратимую транслокацию СК-2 из цитоплазмы в ядро эукариотических клеток (Filhol et al.,1990, Ahmed et al.,1993]. По-видимому, CK-2 распределяется по всему клеточному пространству неравномерно и в значительной степени зависит от локализации природных субстратов
фермента, определяемой физиологическим состоянием клетки. Наблюдаемая во многих работах активация СК-2 может быть объяснена переходом фермента в обычно исследуемую фракцию свободных цитозольных белков из мембрано/цитоскелет-связанной фракции.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в экспериментальном обосновании предположения о том, что регуляция активности СК-2 в клетках эукариот на посттрансляционном уровне осуществляется за счет обратимой локализации фермента в различных клеточных структурах.
В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1.Охарактеризовать изменение активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков в процессе прогестерон-стимулируемого мейотического созревания ооцитов Rana temporaria.
2. Определить ферментативную активность СК-2 в клеточных
фракциях (мембраны, цитоскелет, нуклеопротеиды, свободные белки
цитоплазмы), полученных из ооцитов, находящихся на разных стадиях
мейотического созревания.
3. Определить влияние нейродегенеративных процессов (болезнь
Алыдгеймера, шизофрения) на активность СК-2 во фракции свободных
РНК-связывающих белков мозга человека.
4. Исследовать in vitro зависимость РНК-связывающей и
ферментативной активностей СК-2 от величины рН.
Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование характера изменения активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков в процессе мейотического созревания ооцитов Rana temporaria. Показано, что возрастание активности СК-2 при стимуляции ооцитов прогестероном обусловлено как посттрансляционной активацией фермента, так и биосинтезом СК-2 de novo на завершающих стадиях созревания. Впервые показано, что активация СК-2 на посттрансляционном уровне является результатом перехода мембрано- и цитоскелет-связанных фракций в свободную '"' 2 ' >
цитозольную фракцию. Обнаружено резкое падение удельной
активности СК-2 во фракции свободных РНК-связывающих белков при
нейродегенеративных процессах в мозге человека. Тотальная клеточная активность СК-2 в исследованных процессах остается постоянной. Выявлена зависимость РНК-связыаающей актионости СК-2 от величины рН в созревающих ооцитах Rana temporaria^ Предполагается, что изменение рН от 6,5 до 7,5, наблюдаемое при созревании ооцитов и приводящее к диссоциации комплексов СК-2 - РНК служит механизмом регуляции ферментативной активной и компартментализации СК-2.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международных симпозиумах в г, Пущино 1991 (Россия), о г. Иерусалим 1993 (Израиль), докладывались на рабочих семинарах и конкурсах научных работ ИНБИ РАН (1991, 1992), совместных семинарах с Институтом биологии развития РАН, и с Институтом белка РАН. По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работ, 1 подготовлена к печати.
Сірухіура.ллбьсм_рабйш. Диссертационная работа состоит из «ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводоо и списка цитируемой литературы (180 ссылок). Работа изложена на 110 стр. машинописного текста, содержит 25 рисунков и 3 таблицы.
