Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Синтез мелатонина 10
1.2 Мелатонин - мультифункциональное соединение 10
1.3 Локальные функции мелатонина 13
1.3.1 Сетчатка 13
1.3.2 Слизистая оболочка кишечника 14
1.3.3 Кожные покровы 14
1.3.4 Клетки крови 15
1.4 Мелатонин -как фармакологический агент. 16
1.5 Распад 17
1.5.1 Структура молекулы мелатонина 22
1.5.2 Активированные кислородные метаболиты
1.5.2.1 Супероксид-анион радикал (02*~) 23
1.5.2.2 Перекись водорода (Н202) 24
1.5.2.3 Гидроксильный радикал (НО*) 26
1.5.2.4 Синглетный кислород ('02) 27
1.5.3 Другие окислители неферменгативной природы 29
1.5.4 Окислители ферментативной природы
1.5.4.1 Индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО) 29
1.5.4.2 Миелопероксидаза (МПО) 30
1.5.4.3 ЦитохромС 31
1.5.5 Системы ex vivo 32
1.6 АФМК и АМК- факты и перспективы 33
1.7 Резюме 34
2 Материалы и методы
2.1 Экспериментальные животные 35
2.2 Реактивы 35
2.3 Оборудование 36
2.4 Методы
2.4.1 Синтез, очистка и идентификация АФМК 37
2.4.2 Определение содержания мелатонина, АФМК и АМК с помощью ВЭЖХ 38
2.4.3 Методы экстракции анализируемых веществ 39
2.4.4 Определение АФМК и АМК в крови и сетчатке крыс 41
2.4.5 Определение содержания АФМК в спинномозговой жидкости крыс методом микродиализа in vivo 41
2.4.6 Определение мелатонина АФМК и АМК в крови, сетчатке и эпифизе цыплят и изучение их кинетики 43
2.5 Получение и обработка данных 44
3 Результаты
3.1 Определение спектральных характеристик продукта окисления мелатонина перекисью водорода 45
3.2 Масс-спектрометрический анализ 47
3.3 Экстракция и анализ предполагаемых метаболитов мелатонина в биологическом материале с помощью ВЭЖХ 48
3.4 Определение содержания мелатонина, АФМК и АМК в крови, сетчатке и эпифизе цыплят и изучение их кинетики 52
3.5 Определение содержания АФМК в крови и сетчатке крыс 57
3.6 Определение содержания АФМК в спинномозговой жидкости крыс методом микродиализа in vivo 60
4 Обсуждение 62
5 Выводы 73
6 Список литературы 74
- Синтез мелатонина
- Экспериментальные животные
- Синтез, очистка и идентификация АФМК
- Определение спектральных характеристик продукта окисления мелатонина перекисью водорода
Введение к работе
Актуальность темы
Мелатонин - продукт превращения аминокислоты триптофана - является биологически активным соединением, привлекающим в настоящее время внимание большого числа исследователей во всем мире. Мелатонин обнаружен практически у всех живых существ - от простейших до млекопитающих.
Функции мелатонина разнообразны и во-многом определяются тканью, синтезирующей это соединение. У высших позвоночных мелатонин образуется ферментативно, в результате последовательного гидроксилирования, декарбоксилирования, N-ацетилирования и О-метилирования аминокислоты триптофана. Основным местом образования мелатонина является эпифиз, однако он вырабатывается также в сетчатке, слизистой оболочке кишечника, кожных покровах и других тканях (Cassone et al., 1993; luvone and Besharse, 1983; Huether et al., 1992; Fischer et al., 2006). В сетчатке и эпифизе его синтез имеет циклический характер с максимумом в ночное время, благодаря чему мелатонин выступает гормональным сигналом фазы суточных, а также сезонных ритмов (Cassone et al., 1993; Korf, 1994). Помимо этого, мелатонин выполняет локальные функции, регулируя синтез аминокислот и дофамина в сетчатке (Ribelayga et al., 2004), моторику кишечника (Lucchelli et al., 1998), активность ферментов антиоксидантной защиты (Mayo et al., 2002) и проч.
Благодаря широкому спектру модулирующих эффектов и низкой токсичности (Sugden, 1983) в некоторых странах мелатонин используется как биологически активная добавка при коррекции различных нарушений сна и как вспомогательный препарат в лечении онкологических заболеваний и патологий нервной системы (Sainz et al., 2003; Pappolla et al., 2000). Дозы мелатонина, применяемые в клинике на несколько порядков превышают физиологические (Dollins et al., 1994), что делает необходимым изучение путей его катаболизма. Между тем, этой проблеме пока не уделяется должное внимание.
Основной механизм распада мелатонина заключается в его гидроксилировании цитохромами группы Р450 печени с образованием 6-
гидроксимелатонина, который в виде конъюгатов с сульфатом или глюкуронидом поступает в почки и выводится с мочой (Kopin et al., 1961). По этому пути метаболизируется мелатонин, находящийся в крови.
Не исключалось также и существование других, отличных от основного, путей его катаболизма. Это предположение подтвердилось, когда в сетчатке лягушек была обнаружена система локального распада мелатонина, идущего с образованием 5-метоксииндолуксусной кислота и 5-метокситриптамина (Grace et al., 1991). Это интенсифицировало исследования по поиску альтернативных путей его деградации.
Образование кинурениновых продуктов рассматривалось как один из возможных механизмов распада мелатонина, так как известно, что кинурениновый путь занимает центральное место в катаболизме предшественника и структурно родственного мелатонину соединения -триптофана (Тусе, 1985). В начале 90-х г. появились данные по взаимодействию мелатонина с активными формами кислорода и некоторыми ферментами in vitro, приводящему к образованию кинурениновых продуктов (Stasica et al., 2000). Эти вещества были выделены в чистом виде: ими оказались Ы-ацетил-Ы-формил-5-метоксикинуренамин (АФМК) и Ы-ацетил-5-метоксикинуренамин (АМК) (Tan et al, 2000). На культурах клеток была показана способность АФМК и АМК ингибировать синтез простагландинов, экспрессию провоспалительного фактора циклооксигеназы-2, подавлять образование TNF-a и IL-8, индуцированное липополисахаридом в нейтрофилах и проч. (Мауо et al., 2005; Tan et al., 2007). Установили также, что при добавлении мелатонина в культуру нейтрофилов или макрофагов основным продуктом его распада являлся АФМК, затем трансформирующийся в АМК (Rodrigues М., et al., 2003).
Однако прямые доказательства образования этих соединений in vivo, отсутствовали, что обусловило наш интерес к данному предполагаемому пути распада мелатонина. В соответствии с этим были сформулированы цели и задачи исследования.
Цели и задачи исследования
Целью нашей работы являлась проверка существования кинуренинового пути окисления мелатонина идущего с образованием АФМК и АМК in vivo у представителей двух классов позвоночных, цыплят и крыс. В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи исследования:
Синтез АФМК и его идентификация.
Разработка методов экстракции и определения АФМК и АМК в биологическом материале (сыворотка, сетчатка) с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Определение АФМК и АМК в сетчатке, сыворотке крови и эпифизе цыплят и сетчатке и сыворотке крови крыс
Исследование кинуренинового пути метаболизма мелатонина в спинномозговой жидкости крыс с помощью метода микродиализа на свободно движущемся животном.
Положения, которые выносятся на защиту
В организме крыс и цыплят существует кинурениновый путь распада мелатонина, идущий с образованием АФМК и АМК.
Разработанный метод определения АФМК и АМК с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии является высокочувствительным и может быть использован для серийного количественного анализа этих соединений в биологическом материале.
Научная новизна работы
Впервые показана окислительная деградация мелатонина по кинурениповому пути in vivo; у цыплят и крыс определен вклад кинуренинового пути в общий катаболизм мелатонина в крови и сетчатке этих видов; прослежена кинетика образования и убыли АФМК и АМК в сыворотке крови и сетчатке цыплят при введении мелатонина.
Разработан пригодный для серийных измерений метод анализа кинурениновых производных мелатонина - АФМК и АМК в биологическом материале с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с различными вариантами детектирования.
Впервые показано, что в сетчатке крыс кинурениновый путь является одним из основных механизмов распада мелатонина.
Разработан метод мониторинга содержания АФМК в спинномозговой жидкости крысы методом микродиализа in vivo (на свободно движущемся животном).
Научно-практическая ценность работы
Теоретическое значение работы состоит в доказательстве существования кинуренинового пути распада мелатонина у представителей двух классов позвоночных - цыплят и крыс, и сравнительном анализе его вклада в общий пул метаболитов мелатонина в разных тканях.
Как показали наши исследования, до 35% мелатонина в сетчатке крыс может трансформироваться по кинурени новому пути. Это делает необходимым учет возможных эффектов АФМК и АМК при применении мелагонина как фармакологического агента.
Благодаря простоте, высокой чувствительности и экономичности, разработанный в настоящем исследовании метод определения АФМК и АМК с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ может быть использован в серийных исследованиях содержания данных соединений в биологическом материале.
Примером практической реализации разработанного метода является использование его в сочетании с техникой микродиализа для определения продуктов распада мелатонина в спинномозговой жидкости на свободно движущемся животном.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены в форме докладов и презентаций на VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002 г.), 5-й Российской медико-биологической молодежной конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2002), X Международной конференции молодых исследователей "Ломопосов-2003" (Москва, 2003), а также дважды - на заседаниях Ученого Совета Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова РАН (в 2002 и 2003 гг.)
Струкгура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, в которые входят методы исследований, результаты исследований и обсуждение полученных результатов, выводов и списка цитированной литературы. Основной текст диссертации изложен на 73 стр., в число которых входят 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 10 отечественных и 174 иностранных источников.
Все исследования проведены в сотрудничестве и под непосредственным руководством к.б.н. Н.В. Поздеева, сотр. ИЭФиБ им. И.М. Сеченова РАН, опыты по микродиализу крыс in vivo проводились совместно с сотр. ИЭФиБ им. И.М. Сеченова РАН, к.б.н. Е.В. Филатовой и к.б.н. А.А. Орловым. Работы по изучению содержания АФМК и АМК на цыплятах осуществлялись в лаборатории проф. P.M. Iuvone, унив. Эмори, Атланта, США. Масс-спектрометрический анализ АФМК проведен к.х.н., доц. Кузнецовой Л.М. на базе химического факультета, СПбГУ, Санкт-Петербург, Россия, стандартные растворы АМК любезно предоставлены проф. R. Reiter, унив. шт. Техас, Сан-Антонио, США.
Исследования финансировались из средств грантов CRDF № RUB 1-2637-ST-05, а также РФФИ № 00-04-49220
Синтез мелатонина
У позвоночных животных мелатонин вырабатывается в различных тканях, однако в основном он синтезируется в шишковидной железе (эпифизе). За счет тесной связи с центральным циркадианным осциллятором, расположенным в гипоталамусе, синтез мелатонина имеет циклический характер с максимумом в темное время суток (Cassone et al., 1993).
Мелатонин образуется из незаменимой аминокислоты триптофана (Sun et al., 1999). В процессе синтеза принимают участие 4 фермента (рис. 1), два из которых, арилалкиламин-Ы-ацетилтрансфераза и гидроксииндол-О метилтрансфераза предположительно выполняют регуляторную функцию (Borjigin et al., 1999; Reiter, 1991).
Количество мелатонина в эпифизе в ночное время достигает 7.4 нгу птиц (Cogburn et al., 1987) и до 2 нг у млекопитающих (Miguez et al., 1998), однако он не запасается, а за счет густой сети капилляров быстро попадает в кровеносное русло. Максимальное содержание мелатонина в сыворотке крови высших позвоночных составляет от 34.8 до 200 пг/мл (Rousseau et al., 1999), а общее его количество, вырабатываемое эпифизом, у здорового человека за сутки может доходить до 28.8 мкг (Lane and Moss, 1985). Помимо крови, мелатонин способен диффундировать в спинномозговую жидкость и у человека присутствует в ней в количестве до 230 пг/мл (Rousseau et al., 1999; Longatti et al., 2006). 1.2. Мелатонин - мулыифункциональное соединение
Благодаря цикличности синтеза мелатонин выступает гормональным сигналом, регулирующим суточные, а также сезонные ритмы (Cassone et al., 1993; Korf, 1994), к которым относятся циклы репродукции (Pang et. al. 1998; Brotto and Gorzalka, 2000; MacPhee et al., 1975), сезонные линьки (Allain et al., 1994), суточная активность, циклы сон/бодрствование и проч (Yu and Reiter, 1993). Некоторые исследователи указывают также на его действие как модулятора активности ферменюв антиоксидантной защиты (Reiter, 1996).
Большинство эффектов мелатонина связано с его взаимодействием со специализированными мембранными рецепторами, найденными во многих тканях (Sugden et al., 1997). Рецепторы представляют собой интегральные протеины, реализующие свои функции через сопряжение с G.-белками (Witt-Enderby et al., 2003). По сродству к основному лиганду - мелатонину различают два их класса: высокоаффинные ML1 (Kd 75 пМ) и низкоаффинные ML2 (Kd 200 пМ) (Dubocovich et al., 1998). В нервной системе в наибольшем количестве представлены рецепторы МЫ типа, обнаруженые в супрахиазматических ядрах гипоталамуса - месте локализации центрального циркадианного осциллятора, и паравентрикулярном ядре таламуса, что лежит в основе влияния мелатонина на биологические ритмы (Drijfhout, 1996). Его взаимодействие с рецепторами в гипофизе регулирует содержание таких гормонов, как вазопрессин, окситоцин и др. (Yasin юон соон триптофан 5-гидрокситриптофан 5-гидрокситрилтамин (серотонин) -NH - NH
М-ацетил-5-метокситриптамин N-ацетил-б-гидрокситриптамин (мелатонин) рис. 1. Синтез мелатонина in vivo. 1 - трипіофан-гидроксилаза, 2 -декарбоксилаза ароматических аминокислот, 3 - арилалкиламин-N-ацетилтрансфераза, 4 — гидроксииндол-О-мелилтрансфераза. - скорость-лимитирующие ферменты. et al., 1993). Высокая концентрация мест связывания мелатонина обнаружена в сетчатке (Dubocovich, 1985), а также, за пределами нервной системы, в кишечнике, яичниках Т-лимфоцитах (Bubenik, 2002; Itoh et al., 1999; Carrillo-Vico et al., 2004) и некоторых других тканях и органах.
Помимо взаимодействия с мембранными рецепторами мелатонин свободно проникает внутрь клетки и имеет неравномерное субклеточное распределение (Finocchiaro and Glikin, 1998). Места его связывания в цитоплазме колокализованы с актиновыми микрофиламентами (кроме стресс-актина) и сайтами связывания серотонина (Menendez-Pelaez et al., 1993). Показано его взаимодействие с цитозольным кальмодулином (Beyer et al., 1998; Drijfhout, 1996). Мелатонин концентрируется также в периядерной и ядерной областях (Menendez-Pelaez et al., 1993), где отсутствуют актиновые филаменты, причем характер распределения гормона между цитоплазмой и ядром зависит оттого, в какой фазе цикла находи і ся клетка (Menendez-Pelaez et al., 1993; Coto-Montes et al., 2003).
В основе регуляции ферментов антиоксиданти ой защиты лежит способность мелатонина непосредственно влиять на их транскрипцию (Mayo et al., 2002; Rodriguez, 2004), но вопрос о специализированных ядерных мелатониновых рецепторах, как это описано для стероидных гормонов, остается открытым. Описано взаимодействие мелатонина с группой ретиноид Z рецепторов: a (RZRa) и b (RZRb) типов, принимающих участие в лиганд-индуцируемом контроле транскрипции некоторых генов (Carlberg, 2000; Smirnov, 2001), но роль мелатонина в этом процессе до сих пор не ясна.
Экспериментальные животные
В работе были использованы мелатонин и 30% Н2О2 (Sigma, США), стандарт АФМК (синтезирован и очищен нами как описано в разделе "Методы"), стандарт АМК (предоставлен лабораторией проф. Russel J. Rciter (унив. шт Техас, США), газообразный азот (AirGas, США). Хлористый метилен (НеваРеактив, Россия) и метанол (Fisher Co., США) использовали при экстракции; ацетонитрил (Криохром, Россия), Н3РО4 и К2НР04 (Fisher Co., США) - как компоненты подвижной фазы для ВЭЖХ.
Дополнительную деионизацию и ультрафильтрацию дистиллированной воды проводили на установках US Filter Purelab Plus PL5114 (U.S. Filter, США) или Millipore (Bedford, США). Все реактивы имели квалификацию степени очистки не ниже X4/HPLC grade, если не оговорено иное. Анализ флюоресценции АФМК осуществляли на спектрофлюоримегре RF-1501 (Shimadzu, Япония). Спектрофотометрический анализ проводили с использованием спектрофотометра Specord М-40 (Karl Zeiss, ГДР). Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием масс-спектрометра MX-1303 (Россия).
Для анализа АФМК с флюориметрическим детектированием использовали систему Agilent Technologies 1100 series (Agilent Technologies, USA), состоящую из насоса, дегазатора, термостатируемого автосэмплера и флюориметрического детектора. В системе использовалась аналитическая обращенно-фазовая колонка Cis ODS Ultrasphere 5 им 4.6x250 мм (Beckmann-Coulter, США) либо Zorbax Eclipse XDB С8 5 дм, 4.6x150 мм (Agilent Technologies, США), с предколоночным картриджем NewGuard RP-18, 7 им 3.2x15 (PerkinElmcr, США). Обе колонки обладали сопоставимым разрешением. Мобильная фаза состояла из 20 % ацетонитрила и 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7) (об/об).
ВЭЖХ анализ с электрохимическим детектированием выполняли на установке состоящей из следующих модулей: насоса LKB Bromma 2150 (LKB, Швеция), контроллера LKB Bromma 2152 (LKB, Швеция), термостатируемого автосэмплера ISS-100 (PerkinElmer, США), термостата RM6 (Brinkmann , США) и электрохимического детектора ESA Coulochem 111 с аналитической кулонометрической ячейкой 5011 (Chelmsford, США). В системе использовалась аналитическая обращенно-фазовая колонка С is ODS Ultrasphere 5 JXM 4.6x250 мм (Beckmann-Coulter, США) с предколоночным картриджем NewGuard RP-18, 7 им 3.2x15 (PerkinElmcr, США). Мобильная фаза сосюяла из 17.5% ацетонитрила и 82.5% 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7) (об/об).
Реакционная смесь состояла из 30% водного раствора Н202, и спиртового раствора мелатоншіа. Реакция возможна только в присутствии кислорода (Fowler et al., 2003; Maharaj et al., 2002;), поэтому инкубационную смесь не деаэрировали. Мелатонин предварительно растворяли в 5% метаноле в концентрации 10 мМ, затем необходимое количество его маточного раствора смешивали с Н2О2 до достижения конечной концентрации 1 мМ. Инкубацию проводили при температуре 20±2С без доступа света. Для определения Хтах предполагаемого метаболита и кинетики его образования, смесь помещали в кварцевые кюветы (h=l см) и проводили спектрофотометрический анализ. Поглощение пробы измеряли в диапазоне длин волн 190 - 600 нм при температуре 20±2С, через 0, 0.5, 1, 2, 6, 24 и 48 часов от начала инкубации. Определенную Лщах и данные по кинетике реакции использовали при полупрепаративном выделении исследуемого соединения с помощью ВЭЖХ.
Компоненты смеси разделяли с использованием полупрепаративной ВЭЖХ со спектрометрическим детектированием при рабочей длине волны 340 нм. Элюат отбирали в пробирки (объем пика 500 цл), после чего проводили жидкофазную экстракцию АФМК, смешивая его в соотношении 1:1 с хлористым метиленом, водную фазу удаляли, оставшуюся часть высушивали в токе азота и хранили при -32С. Полученное в кристаллическом виде вещество использовали для масс-спектрометрического анализа и как стандарт в дальнейших исследованиях.
Флюориметрический анализ образовавшегося соединения проводили в кварцевых кюветах (h=l см) в диапазоне длин волн эмиссии 350-700 нм при длине волны возбуждения 340 нм при температуре 20±2С.
Масс-спектрометрический анализ был необходим для установления отношения масса/заряд синтезированного соединения и проводился с прямым вводом пробы. Ионизация осуществлялась электронным ударом (энергия 70 эВ).
В настоящее время существуют различные способы определения мелатонина в биологическом маїериале. Среди них наибольшей чувствительностью обладают радиоиммунологический метод, метод газовой хроматографии, сопряженный с масс-спектрометрией и ВЭЖХ. Последний был выбран нами по причине того, что во-первых, не дает перекрестной реактивности с другими соединениями со сходной структурой, как в случае радиоиммунологического анализа, во-вторых, прост и дешев в использовании по сравнению с масс-спектрометрическим.
Так как все анализируемые соединения не имеют заряда в физиологическом диапазоне рН, для их разделения удобно использовать хроматографические колонки с неполярной фазой С8 или С,8.
Синтез, очистка и идентификация АФМК
При работе на крысах мы применяли жидкофазную экстракцию анализируемых компонентов. Ввиду незаряженности молекул анализируемых веществ (для мелатонина в системе метанол-вода коэффициент распределения составляет 80/1, расчеты pi) для экстракции использовали неполярный растворитель. При жидкофазной и при твердофазной экстракции использовали неполярные фазы - хлористый метилен и октадецил-модифицированный силикагель.
Непосредственно перед анализом пробы размораживали, смешивали с хлористым метиленом в соотношении 1:2 в течение 30 сек, затем центрифугировали 1 мин при 8000 g для улучшения разделения фаз. Водную фазу удаляли, оставшуюся часть высушивали в токе азота, затем ресуспендировали в 20% ацетонитриле (об/об) и анализировали с помощью ВЭЖХ.
В работе на цыплятах мы использовали твердофазную экстракцию (ТФЭ). Использование системы Manifold (Waters, USA) для вакуумной экстракции позволяет одновременно анализировать до 12 образцов, что позволяет повысить эффективность экстракции и увеличить производительность исследований.
Для проверки эффективности ТФЭ использовали следующие стандартные количества реактивов: 59, 118, 236 472 и 944 пг АМК и 0.625, 1.25, 2.5, 5 и 10 нг АФМК, растворенные в 1 мл 0.1 М калий-фосфатного буфера (рН 7.4) или в сыворотке крови. Для ТФЭ использовали картриджи с неполярной Cis-октадецил-привитой фазой (J.T.Baker, США).
Перед проведением экстракции картриджи прекондиционировали 1+1 мл абсолютного метанола и 1+1 мл воды. Далее, на картриджи наносили пробы исследуемого материала и проводили экстракцию. По окончании экстракции картриджи повторно промывали 1 мл 7% метанола для удаления примесей, затем 300+300 мкл абсолютного метанола для диссоциации исследуемых соединений с картиджа. Сушку проб проводили в стеклянных пробирках под током азота, сухой остаток ресуспендировали в 10 мкл мобильной фазы и анализировали хроматографически.
Отбор проб проводили в середину темновой фазы цикла. Кровь собирали в стеклянные пробирки и инкубировали при +4С до контракции тромба. Содержимое пробирок центрифугировали 10 мин при 2200 g, затем сыворотку (верхняя фракция) отбирали и до анализа хранили при -85С.
Мелатонин (10 мг) растворяли в 1 мл 5% этанола (об/об) и вводили животным і.р. в дозе 15 мг/кг. Отбор проб крови и сегчаюк в опытных и контрольных группах животных проводили через 30 мин после инъекции, в середину темновой или световой фазы цикла.
Кровь инкубировали 1 час при +4С до образования сгустка, затем центрифугировали 12 мин при 2500 g. Сыворотку (верхняя фаза) отбирали и хранили при температуре ниже — 195С.
Сетчатки отбирали и замораживали при температуре ниже -170С. Перед анализом 2 сетчатки/пробу гомогенизировали при +4С в 200 мкл 66 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.4) в стеклянном гомогенизаторе, затем проводили жидкофазную экстракцию анализируемых веществ. После экстракции для удаления микрочастиц пробы фильтровали через 0.44 мкм фильтр центрифугированием 5 мин при 10000 g при +4С и проводили их хроматографический анализ.
В основе метода микродиализа лежит принцип диффузии веществ через полупроницаемую мембрану. Канюлю, состоящую из полупроницаемой мембраны имплантируют в ткань, после чего через нее подается изотонический раствор, в который из окружающей ткани осуществляется диффузия веществ. На выходе из канюли диализат собирается и анализируется. За счет использования реактивов квалификации не ниже ХЧ и мембранной ультрафильтрации, дополнительной очисіки образцов диализата перед анализом не требуется.
Определение спектральных характеристик продукта окисления мелатонина перекисью водорода
Фотосенсибилизаторы при поглощении света переходят на более высокие энергетические уровни и способны переводить другие молекулы, в частности, кислород, в возбужденное состояние. В модельной системе, состоящей из мелатонина и фотосенсибилизаторов, таких как протопорфирин IV или метиленовый синий и облучении УФ-светом слабой интенсивности, было показано образование АФМК (de Almeida et al., 2003). Всё это приводит к большой предрасположенности сетчатки к фотоиндуцированному окислительному стрессу, опосредованному свободнорадикальными процессами (Островский, 2005). Во многих работах показано, что длительное облучение сетчатки светом видимого диапазона приводит к деградации фоторецепторов и может вызвать слепоту (Organisciak and Winkler, 1994). Так как в различных реакционных системах с активными формами кислорода in vitro основным продуктом распада мелатонина являлся АФМК, то сетчатка рассматривалась как место предпочтительного его поиска. Мы не исключали также возможности прямой фотодеградации мелатонина, которая показана, по крайней мере, in vitro (Andrisano et al., 2000).
Так как в сетчатке млекопитающих, в отличие от других позвоночных, не обнаружено системы локальной деградации мелатонина, она могла бы осуществляться при его взаимодействии с активными формами кислорода. Это подтверждают и исследования в которых введение а-токоферола и диметилтиомочевины - жиро- и водорастворимых аптиоксидантов значительно снижало скорость распада мслагонина в сетчатке (Siu et al, 1999; Pozdcyev and Iuvone,2001).
Мы определяли количество АФМК в сетчатке пнгактных крыс как ночью, так и днем с целью выяснения существования этого механизма распада in vivo. Абсолютные значения содержания этого соединения составили в среднем 36 пг/ сетчатку в световую фазу цикла и 56 пг/сетчатку в темновую. Соотношение мелатонин/АФМК, как уже указывалось, составляло днем 2/1, ночью 3.5/1, т.е. количество АФМК в зависимости от времени суток колебалось в пределах 30% - 20% от содержания мелатонина в сетчатке крысы. При введении мелатонина в дозе 15 мг/кг, уровень АФМК в сетчатке возрастал в 1.6 раза по сравнению с дневным.
Возникает вопрос: если в дневное время распад, связанный с реакцией мелатонина с активными формами кислорода вызван взаимодействием с фотосенсибилизаторами, что вызывает деградацию мелаюнпна в ночное время, особенно учитывая, что максимальное его содержание приходится как раз на этот период?
Основным местом синтеза мелатонина в сетчатке являются фоторецепторы (Iuvone et al., 2005). В темное время суток в фоторецепторах активизируются процессы, требующие больших затрат энергии, такие, как темновой ток, обратный захват глутамата (Berman, 1991) и проч. Следствием этого является высокое потребление кислорода, что подтверждают исследования по измерению его парциального давления в зоне внутреннего сегмента фоторецептора - места локализации митохондрий - ночью оно падает в 3 раза по сравнению с дневным уровнем и составляет 10 мм.рт.ст (Островский, 2005). Принимая во внимание, что до 38% мелатонина может быть локализовано в митохондриях (Poon and Pang, 1992) можно сделать вывод о формировании условий, предпочтительных для его окисления за счет повышенной продукции свободно-радикальных соединений митохондриями. Действительно, как показали наши исследования, ночью количество АФМК, приходящееся на одну сетчатку увеличивается почти в 2 раза (рис. 25). То, что даже при введении больших количеств мелатонина не происходит существенного увеличения содержания АФМК можно объяснить ограниченным количеством активных форм кислорода на которое, по видимому не влияет количество мелатонина в крови.
Активность ключевых ферментов синтеза мелатонина в сетчатке носит циклический характер и максимальна в темновую фазу цикла (Bernard et al., 1997; Iuvone et al., 1997). Кроме того, в ряде работ показаны суточные колебания интенсивности метаболизма сетчатки даже в условиях постоянной темноты (Поздеев, 1999). Что касается фотоокисления мелатонина, то для его распада с образованием АФМК in vitro требуется длительное облучение УФ-светом высокой интенсивности, что не реализуется в физиологических условиях.
Содержание АФМК в сетчатке крыс значительно превосходит таковое в сыворотке крови - 30% в сетчатке интактных животных против 0.01% в сыворотке крыс с предварительно введенным мелатонином в дозе 15 мг/кг.
В сыворотке крови интактных крыс АФМК обнаружить не удалось, то есть в крови сетчатки это соединение содержаться также не могло. Отсутствие в крови исключает и накопление АФМК в сетчатке. Это подтверждают и измерения АФМК проведенные в крови и сетчатке у крыс в предварительно введенным мелатонином - его количество в сетчатке по сравнению с интактными животными возрастало не более, чем на 20%, однако в случае аккумуляции прирост был бы многократно выше, гак как в крови оно составляло 1.5 нг/мл. Таким образом наличие АФМК, по-видимому, является следствием локального распада мелатонина в этой ткани.