Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени обнаружено большое разнообразив вазопрессин- и окситоцин-подобных гормонов у разных представителей животного мира: около 13-у позвоночных и 5 - у беспозвоночных (Asher, 1993). Все они имеют сходную структуру из 9 аминокислот, причем различия в аминокислотных заменах в положениях 3 и S определяют принадлежность пептидных гормонов к вазопрвссиновому или окситоциновому ряду и различие их функций в организме. Аргинин-вазотоцин встречается от круглоротых до птиц и сменяется на вазопрес-сины у млекопитающих, появляясь впервые у сумчатых (Mahlmann et а!, 1994). В окситоциновом ряду гормонов самые низшие представители позвоночных - хрящевые рыбы - имеют множество окситоцин-подобных пептидов, что, как предполагают, связано с отсутствием жестких селективных ограничений в функции гормона и молекуле его рецептора (Chauvet et al, 1994). Изотоцин костистых рыб сменяется у двоякодышащих рыб и амфибий на мезотоцин, который сохраняет эволюционную стабильность вплоть до окситоцина млекопитающих (Chauvet et al, 1995).
Вазопрессин-подобные гормоны играют большую роль в осморегу-ляции (Наточин и др., 1989), вазопрессорных эффектах (Malvin, 1993). в регуляции гликогенолиза (Ade ot al, 1995), секреции стероидных (Iwamuro ot al, 1993) и кортикотропных (Tonon et al, 1986) гормонов, а окситоцин-подобные - в процессах размножения (Boyd, 1994). Кроме того, и те, и другие обладают рядом эффектов, регулируемых ЦНС (влияние на локомоторную активность (Boyd, 1991), дыхательные и сердечно-сосудистые эффекты (Chiu. Lee, 1992), регуляция' секреции эндолимфы (Ferrary et al, 1991) и др.).
Гормоны секретируются в нейронах гипоталамуса и высвобождаются из их аксонов в нейрогипофизе под действием различных физиологических сигналов. Они циркулируют в крови и связываются со специфическими рецепторами в разных тканях. 3 типа ваэопрессиновых и 1 тип ок-ситоцинового рецепторов млекопитающих клонированы к настоящему времени: Vi, (Morel et al, 1992; Thibonnier et al, 1994), \Л, (Sugimoto et al, 1994), V2 аргинин-вазопрессиновые (Lolait et al, 1992; Birntv mer et al, 1992; Ufer et al. 1995), V? лизин-вазопрессиновый (Gorbulev et al, 1993) и окситоциновые (Kimura et al, 1992; Gorbulev et al, 1993; Rozen et al, 1995) рецепторы. Окситоцинсвые рецепторы, как и вазолрессиновые рецепторы
Vi типа, действуют через инозиттрифосфат/кальциевую систему вторичных посредников, a V2 рецепторы - через активацию аденилатциклазы. Все они принадлежат к G-белок-свяэывающим рецепторам. Становление функций гормонов у млекопитающих тесно связано с изменением структуры гормона в ряду организмов и коэволюцией гормон-рецепторного комплекса.
Амфибии представляют особый интерес в изучении эволюционного развития двух семейств нейрогипофизарных гормонов. Выход амфибий из воды на сушу в процессе онтогенеза, а также появление в ходе эволюции амфибий полуводных и наземных форм, приводит к перестройке системы осморегуляции организма. Возможность существования амфибий в новых условиях может быть связана с появлением новых нейрогипофизарных гормонов (например, мезотоцина) и специфических к ним рецепторов, взаимодействующих с различными эффекторными системами.
Клонированные к настоящему времени аргинин-вазотоциновый (Mahlmann et al, 1994) и иэотоциновый (Hausmann et at, 1995) рецепторы костистых рыб являются, очевидно, эволюционными предшественниками вазопрессин- и окситоцин-подобных рецепторов других позвоночных. Изучение и клонирование таких рецепторов у амфибий открывает путь к пониманию эволюции функций вазопрессин- и окситоцин-подобных гормонов при смене условий существования.
Мочевой пузырь амфибий в течение многих лет является классическим объектом исследования действия нейрогипофизарных гормонов в механизмах осморегуляции. К настоящему времени биохимическими методами показано наличие У2-подобных рецепторов на эпителиальных клетках мочевого пузыря жабы, связанных с активацией аденилатциклазы и участвующих в процессе осморегуляции (Uchiyama, 1994; Lyall et al, 1994). Кроме того, предполагают существование других типов рецепторов, связанных, возможно, с другой системой вторичных посредников и оказывающих модулирующее действие на осморегуляторные процессы. Однако, до сих пор не были клонированы рецепторы нейрогипофизарных гормонов у амфибий, что позволило бы установить структуру и свойства рецепторов и подойти к пониманию их функциональной роли.
Различие а структуре гормонов разных позвоночных обусловливает особенности структуры связывающего центра рецептора. Поэтому сравнение последовательностей разных рецепторов позволит подойти к иден-
тификации участка связывания гормона на молекуле рецептора и к определению его специфичности к тем или иным лигандам.
В связи с этим была проведена работа по клонированию оксито-цин/вазопрессин-подобного рецептора из мочевого пузыря жабы Bufo marinus и исследование его функциональных свойств. Цель и задачи исследования. Целью работы было клонирование оксито-цин/вазопрессин-подобного рецептора из мочевого пузыря жабы Bufo marinus и исследование его функциональной характеристики. Соответственно, были поставлены следующие задачи:
-
Клонировать кДНК окситоцин/вазопрессин-подобного рецептора из мочевого пузыря жабы.
-
Изучить его сродство к различным агонистам и антагонистам нейрогипофизарных гормонов.
-
Изучить систему вторичных посредников, через которую работает клонированный рецептор.
-
Изучить экспрессию мРНК рецептора в разных тканях жабы. Научная новизна работы. Впервые была клонирована кДНК рецептора окситоцин/вазопрессинового семейства из мочевого пузыря жабы. Сравнение аминокислотных последовательностей клонированного рецептора с другими представителями окситоцин/вазопрессинового семейства показало, что клонированный рецептор относится к окситоциновому подсемейству. В экспериментах по функциональной характеристике клонированного рецептора было выявлено его наибольшее сродство к мезотоци-ну. Было показано, что связывание мезотоцинового рецептора с лигандом стимулирует активацию фосфолипазы С. Экспрессия мРНК рецептора была обнаружена в мочевом пузыре, почке, мозгу и скелетных мышцах жабы. Клонирование мезотоцинового рецептора позволило охарактеризовать эволюционное развитие окситоцин-подобных рецепторов при переходе от водных организмов к наземным: от изотоцинового рецептора рыб к окситоциновому рецептору млекопитющих.
Практическое значение работы. Нейрогипофизарные гормоны - аргинин-вазотоцин и мезотоцин - участвуют в регуляции различных процессов, в частности, процесса размножения, у птиц. Клонирование мвзс. оцинового рецептора и характеристика его фармакологических свойств позволяет приблизиться к пониманию регуляции размножения у домашней птицы, что может иметь большое значение для птицеводства.
Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, были доложены на конференции Fall Meeting/Gesellschaft fur Biologische Chemie (Вюрцбург, 1994) и на заседании секции молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова (Санкт-Петербург, 1996). Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на /чГ?страницах, содержит 23 рисунков, 2 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя // литературных источников.