Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Строение и физико-химические свойства лактоферрина 8
1.1.1. Строение молекулы лактоферрина 8
1.1.2. Связывание ионов железа 11
1.1.3. Полимерные формы лактоферрина 12
1.1.4. Деление наизоформы 13
1.2. Метаболизм лактоферрина 13
1.3. Биологические функции лактоферрина 15
1.3.1. Транспорт ионов железа 15
1.3.2. Антимикробные свойства лактоферрина 16
1.3.2.1. Антибактериальная активность 16
1.3.2.2. Антивирусная активность 20
1.3.2.3. Антигрибковая активность 26
1.3.2.4. Антипаразитарная активность 28
1.3.3. Регуляция процессов воспаления 29
1.3.4. Участие ЛФ в процессах пролиферации и дифференцировки клеток 31
1.3.5. Иммуномодулирующие свойства лактоферрина 32
1.3.6. Взаимодействие лактоферрина с различными клетками организма 33
1.3.7. Связывание лактоферрина раковыми клетками. Противораковое действие 34
1.3.8. Взаимодействие лактоферрина с полианионами 35
1.3.8.1. Связывание гепарина 35
1.3.8.2. Взаимодействие с нуклеиновыми кислотами 36
1.3.9. Природа клеточных рецепторов к лактоферрину 37
1.3.10. Ферментативные активности лактоферрина 38
1.3.10.1. РНК-гидролизующая активность лактоферрина 38
1.3.10.2. Предполагаемый механизм гидролиза нуклеиновых кислот 39
1.3.10.3. Протеазная активность лактоферрина 39
1.3.11. Лактоферрин как ингибитор протеаз 40
1.3.12. Лактоферрин как фактор транскрипции 41
2. Материалы и методы 45
2.1. Реактивы и материалы 45
2.2. Методы 47
2.2.1. Получение сорбента анти-ЛФ-сефарозы 47
2.2.2. Выделение ЛФ из молока 47
2.2.3. Определение концентрации ЛФ 48
2.2.4. Получение железонасыщенного лактоферрина 48
2.2.5. Электрофоретический анализ белка 48
2.2.6. "Кислотный шок" препаратов ЛФ 49
2.2.7. Анализ олигомеризации ЛФ с помощью электрофореза 49
2.2.8. Протеолитическое расщепление ЛФ трипсином 49
2.2.9. Получение и очистка 5 -[32Р]-меченых олигонуклеотидов 49
2.2.10. Очистка нуклеотидов 50
2.2.11. Определение активности ЛФ в реакции гидролиза олигонуклеотидов 50
2.2.12. Определение активности ЛФ в реакции гидролиза ДНК фага X и ДНК плазмиды pBR-322 51
2.2.13. Определение нуклеотидфосфатазной активности ЛФ 51
2.2.14. Определение амилолитической активности ЛФ 51
2.2.15. Определение каталитических активностей ЛФ in situ 52
2.2.16. Определение кинетических параметров реакции гидролиза 53
2.2.17. Измерение спектров кругового дихроизма (КД) 53
2.2.18. Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния 53
2.2.19. Измерение светорассеяния 54
2.2.20. Спектрофлуориметрическое определение констант диссоциации комплексов ЛФ с нуклеотидами 55
2.2.21. Влияние нуклеотидов на связывание и гидролиз ON лактоферрином 55
2.2.22. Определение цитотоксичности ЛФ 56
3. Результаты и их обсуждение 57
3.1. Выделение изоформ лактоферрина 57
3.2. Анализ каталитических активностей ЛФ и его изоформ 63
3.2.1. Доказательства принадлежности каталитической активности изоформам ЛФ... 63
3.2.2. Тестирование активностей ЛФ in situ 64
3.2.3. Субстратная специфичность ЛФ 69
3.2.3.1. Нуклеазная и ДНК-фосфатазная активности изоформ ЛФ 69
3.2.3.2. Нуклеотидфосфатазная активность изоформ ЛФ 71
3.2.3.3. Амилолитическая активность изоформ ЛФ 74
3.2.4. ЛФ - как основная ДНКаза, РНКаза и АТРаза молока человека 75
3.2.5. Апоптоз клеток под действием ЛФ 76
3.3. Взаимодействие лактоферрина с АТР и другими нуклеотидами 80
3.3.1. Изучение взаимодействия ЛФ с нуклеотидами методом флуоресцентного титрования и кругового дихроизма 80
3.3.2. Взаимодействие ЛФ с различными нуклеотидами 84
3.3.3. Влияние нуклеотидов на комплексообразование ЛФ с ДНК и его ДНК-гидролизующую активность 86
3.3.4. Анализ возможной природы нуклеотид-связывающих центров ЛФ 91
3.4. Изучение влияния субстратов ЛФ на его олигомерное состояние 94
3.4.1. Олигомерные формы ЛФ в растворе 94
3.4.2. Изучение олигомерного состояния ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния и светорассеяния 95
3.4.3. Изучение олигомерных форм растворов лиофилизованного ЛФ 102
3.4.4. Влияние нуклеотидов на олигомеризацию ЛФ 104
3.4.5. Определение констант диссоциации комплексов олигомерных форм ЛФ с нуклеотидами методами СР и флуоресцентного титрования 107
3.4.6. Влияние олигонуклеотида и олигосахарида на олигомеризацию ЛФ 111
3.5. Природа полифункциональности ЛФ 120
4. Выводы 125
5. Список литературы 126
- Антибактериальная активность
- Определение активности ЛФ в реакции гидролиза олигонуклеотидов
- Нуклеазная и ДНК-фосфатазная активности изоформ ЛФ
- Анализ возможной природы нуклеотид-связывающих центров ЛФ
Введение к работе
Хорошо известно, что материнское молоко для новорожденного - это не только идеально сбалансированная пища, но и комплексная защита организма, направленная, в первую очередь, на восполнение недостаточности собственного иммунитета ребенка. Наряду с Mono-, олиго- и полисахаридами, витаминами и витамино-подобными соединениями, минеральными солями и микроэлементами, молоко содержит различные ферменты, нуклеиновые кислоты и нуклеотиды, гормоны и гормоно-подобные соединения, факторы роста и дифференцировки клеток и, наконец, комплекс так называемых защитных факторов и большое количество жизнеспособных клеток [1-3].
Роль Сахаров, витаминов, гормонов, микроэлементов, минеральных солей, содержащихся в грудном молоке, достаточно очевидна. Казеин, ос-лактальбумин, а также моно-, олиго- и полисахариды ответственны за питательную функцию: их расщепление приводит к образованию аминокислот и олигосахаридов, которые, в основном, используются для синтеза новых биополимеров, необходимых растущему организму ребенка [4].
Целый комплекс различных факторов ответственен за защитную роль молока. Однако основу защитной функции составляют белковые компоненты молока. Это белки специфической защиты организма: иммуноглобулины, интерфероны, система комплемента, бифидогенный фактор, ускоряющий рост бифидобактерий и ингибирующий колонизацию кишечника кишечной палочкой [3, 5] и широкий спектр белков, обеспечивающих неспецифическую защиту. Среди них лактоферрин, лизоцим, сс-лактальбумин, к-казеин, лактопероксидаза [6-8]. Эти белки обеспечивают бактерицидное, бактериостатическое и антивирусное действие. Показано, что белки как специфической, так и неспецифической защиты обладают устойчивостью к протеазам желудочно-кишечного тракта и могут выполнять защитные функции в нативном и частично разрушенном состоянии.
Ряд ферментов, представленных в молоке, также обладает защитными свойствами. Липазы и пероксидазы проявляют бактерицидное и антивоспалительное действие, ингибиторы протеаз отвечают за целостность белков молока [4, 9]. Кроме того, липазы и амилазы принимают участие в расщеплении жиров и полисахаридов, тем самым способствуя образованию питательных компонентов материнского молока [10]. Последние исследования показали, что иммуноглобулины помимо названных свойств обладают способностью катализировать гидролиз нуклеиновых кислот, нуклеотидов и казеина, а также фосфорилирование белков, полисахаридов и липидов молока [11-16].
Большой вклад в комплекс защитных факторов молока вносит лактоферрин -фактор неспецифической защиты ребенка от вирусов и бактерий. Этот гликопротеид с молекулярной массой около 80 кДа помимо молока широко представлен в различных секреторных жидкостях организма, таких как слюна, слеза, секреты носовых желез. Кроме того, ЛФ обнаружен в плазме крови, однако в значительно меньшей концентрации.
Лактоферрин является едва ли не единственным примером белка с уникальным набором биологических свойств различного характера. Будучи трансферриновым белком, он не только регулирует концентрацию ионов железа в крови и секретах, но и обладает ярко выраженным антимикробным и антивирусным действием. Лактоферрин считается одним из важнейших иммунных факторов молока. Он участвует в защитных реакциях организма и регулирует функции иммунокомпетентных клеток. Одно из наиболее интересных свойств лактоферрина - это взаимодействие с полианионами: гепарином, ДНК и РНК. Кроме того, лактоферрин проникает в ядра клеток, связывается со специфическими последовательностями ДНК и активирует процессы транскрипции. Строгая видовая и, в то же время, широкая межорганная специфичность лактоферрина говорят о неоднозначности биологической роли белка.
В последние годы показано, что белок гидролизует РНК, у ЛФ обнаружены структурные мотивы, подобные активному центру РНКазы А. Для установления причин исключительной полифункциональности ЛФ, обуславливающих его биологическую роль в организме, необходимо детальное изучение процессов взаимодействия ЛФ с такими жизненно важными молекулами, как ДНК, РНК, нуклеотиды, полисахариды.
Цель данной работы заключалась в анализе связывающих и гидролизующих активностей различных форм лактоферрина, а также в изучении олигомерного состояния белка и его изменения под действием специфических лигандов.
В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи.
Выделить, исследовать и сравнить различные изоформы ЛФ с индивидуальным набором ферментативных активностей, доказать принадлежность каталитической активности изоформам белка.
Изучить цитотоксическое действие изоформ ЛФ на иммортализованные эукариотические клетки.
Исследовать специфичность взаимодействия белка с различными дезокси- и рибонуклеотидами и проанализировать их влияние на функции ЛФ.
Изучить олигомерное состояние ЛФ и действие специфических лигандов на процессы олигомеризации белковых молекул.
Антибактериальная активность
сПри иммунногистохимических исследованиях тканей печени, полученных с помощью биопсии у больных гепатитами В, С и D, было показано, что ЛФ содержится в ядре и цитоплазме гепатоцитов в 75% исследуемых проб [75]. В случае гепатита С количество ЛФ в тканях росло с развитием заболевания, а при гепатитах В и D такой корреляции не наблюдали, что указывает на различные механизмы участия ЛФ в патогенезе хронического гепатита, вызываемого разными вирусами. При этом у здоровых доноров ЛФ обнаруживается только в васкулярном эндотелии и непаренхиальных клетках печени, но никогда в гепатоцитах, а у больных с воспалением желчных путей и кишечника ЛФ был найден в гепатоцитах. Эти данные могут свидетельствовать о роли ЛФ, как фактора неспецифической защиты при воспалительных заболеваниях печени.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) принадлежит к семейству lentiviridae и является причиной развития синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Данные о содержании ЛФ в плазме крови и слюне ВИЧ-инфицированных весьма противоречивы: сообщается как о пониженном, так и о повышенном уровне белка. Однако наиболее значительное падение уровня ЛФ было обнаружено в слезе и плазме крови тех больных СПИД, которые подвержены различным оппортунистическим инфекциям. Кроме того, была обнаружена прямая корреляция между низким уровнем плазменного ЛФ у матери и перинатальной трансмиссией ВИЧ. Эти клинические данные свидетельствуют об участии белка в защитном механизме против ВИЧ in vivo, антивирусная активность ЛФ in vitro также была продемонстрирована рядом авторов [67]. Механизм действия, как и в случае со многими другими вирусами заключается в препятствии связыванию вирусной частицы с клеткой и ее проникновению внутрь. Однако в данном случае предполагают, что ЛФ связывается с GPGRAF-доменом оболочечного вирусного гликопротеина gpl20, который в свою очередь ответственен за связывание с клеточным рецептором CD4, следствием которого является проникновение вируса в клетку. Таким образом, ЛФ конкурирует с клеточным рецептором CD4 за связывание с вирусной частицей. Дополнительно было показано, что Fe -насыщенный ЛФ обладает гораздо меньшей антивирусной активностью чем апо-форма белка.
Вирус простого герпеса 1 и 2 типа принадлежит к семейству а-герпесвирусов и являются причиной легкой формы заболеваний среди людей с нормальной иммунной системой. Однако в случае ослабленной иммунной системы, например у больных СПИД, пациентов с трансплантированными органами, недоношенных детей, этот вирус может вызывать серьезные и даже смертельные заболевания. Активность апо- и холо-ЛФ против вирусов герпеса 1 и 2 типа in vitro была обнаружена рядом авторов [67], причем Fe3+-насыщенный ЛФ обладает значительно меньшей ингибирующей активностью. Кроме того, иа модельной системе инфекции роговицы мышей было показано антивирусное действие ЛФ in vivo [68]: введение 1% раствора белка значительно уменьшает распространение инфекции, но полностью не ингибирует репликацию вируса. Помимо целого белка, антивирусной активностью обладают его протеолитические фрагменты. Гидролиз трипсином приводит к получению четырех фрагментов белка по два от С- и N-домена, каждый из которых, а также лактоферрицин, ингибируют действие вируса герпеса. Наибольшая активность ЛФ против герпеса ассоциирована главным образом с N-доменом, хотя С-домен и некоторые белки члены семейства трансферриновых белков также демонстрируют некоторую антивирусную активность [42, 69]. Это позволяет предположить, что антивирусная активность является свойством белков трансферринового семейства. Однако нативный белок проявляет большую активность, чем его протеолитические фрагменты. Механизм антивирусного действия ЛФ заключается в ингибировании связывания вируса клетками-мишенями, вероятно путем связывания белка с вирусными частицами.
Цитомегаловирусы принадлежат к семейству р-герпесвирусов. Обычно они попадают в организм в раннем периоде жизни, и их диагностика невозможна из-за отсутствия клинических симптомов. В странах Восточной Азии более 60% населения являются носителями этого вируса. В зависимости от социально-экономического статуса и плотности населения страны серопозитивными по цитомегаловирусам могут быть до 90% жителей. Так же, как и в случае вируса герпеса, заболевания, вызываемые цитомегаловирусами, могут быть смертельно опасными для людей с ослабленной иммунной системой. Зачастую эта вирусная инфекция сопровождает пациентов, больных СПИД, что приводит к значительному сокращению периода их жизни. Была показана антивирусная активность ЛФ против цитомегаловирусов in vitro [67, 70]. Предполагают, что ЛФ связывается с гепарансульфатпротеогликанами (ГСПГ) на поверхности клеток, препятствуя тем самым взаимодействию вируса с клеткой и его проникновению внутрь. Показано, что за связывание с ГСПГ ответственен N-концевой фрагмент ЛФ, содержащий положительно заряженный участок из нескольких аргининов [76]. В данном электростатическом взаимодействии основополагающую роль играет заряд: действие ЛФ усиливалось, когда положительный заряд белка был увеличен с помощью химической модификации, в то время как добавление отрицательного заряда аннулировало антивирусное действие ЛФ.
Помимо прямого антивирусного действия ЛФ in vitro была установлена «косвенная» активность белка in vivo: ЛФ защищает мышей от потенциально летальной для них инфекции цитомегаловирусами, антивирусное действие белка было оптимальным, когда его вводили животным перед заражением вирусом. Дальнейшие исследования показали, что защитный эффект ЛФ достигается за счет регуляции белком активности натуральных киллеров, которые прямо устраняют инфекцию, а также моноцитов и гранулоцитов [67].
Ротавирусы являются причиной гастроэнтеритов небактериалыюго характера у новорожденных детей. Ежегодно в мире наблюдается около миллиона смертных случаев от заболеваний, вызванных ротавирусами. Как апо-ЛФ, так и железонасыщенный ЛФ, оказывают мощное ингибиторующее влияние на развитие простого ротавируса SA-11 in vitro. Показано, что ЛФ связывается с вирусными частицами и тем самым препятствует адсорбции вируса на клетках-мишенях. Кроме того, ЛФ вмешивается в синтез антигена во время развития вирусной инфекции. Таким образом, ЛФ не только предотвращает инфекцию, но и сохраняет антивирусное действие после того, как вирус проник в клетку [67].
Определение активности ЛФ в реакции гидролиза олигонуклеотидов
Моно-, ди- и трифосфаты нуклеозидов (далее - нуклеотиды) очищали согласно работе [12] по стандартной методике препаративной восходящей тонкослойной хроматографией на пластинах SilicaGel 60 F254 в системе диоксан: аммиак: вода (5:1:4 по объему). Положение полос моно-, ди- и трифосфатов нуклеозидов определяли по их поглощению в УФ-свете. Слой силикагеля, содержащий нуклеотид, снимали с носителя и нуклеотид элюировали водой (соотношение сорбент: вода = 1:10 по объему) два раза. Сорбент удаляли с помощью цетрифугирования 5 мин при 10 000 об/мин. Концентрацию иуклеотидов определяли спектрофотометрически с использованием коэффициентов их молярного поглощения, приведенных в работе [154].
Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 5 мМ MgCb, 1 мМ ЭДТА, 10"5-5-10 6 М олигонуклеотид. Реакцию начинали добавлением ЛФ до конечной концентрации белка в смеси 10" -5-10" М. После инкубации в течение 3-5 ч при 37С к реакционной смеси добавляли равный объем 95% раствора формамида, содержащего 0.1 мМ ЭДТА, 0.025% ксиленцианол и 0.025% бромфеноловый синий. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину и методом тонкослойной хроматографии на пластинах Kieselgel в системе диоксан: аммиак: вода (5:1:4) с последующим радиографированием.
Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 5 мМ MgCh, 1 мМ ЭДТА, 150 нг ДНК фага X или 0.5 мкг ДНК плазмиды. Реакцию начинали (\ 7 добавлением ЛФ до конечной концентрации белка в смеси 10-5-10" М. После инкубации в течение 2—4 ч при 37С к реакционной смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего 0.05 бромфеноловый синий, 50% глицерин, 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (буфер для электрофореза: 40 мМ Трис-ацетат, рН 7.5, 1мМ ЭДТА). После проведения электрофореза ДНК окрашивали раствором бромистого этидия (0.5 мкг/мл). 2.2.13. Определение пуклеотидфосфатазпой активности ЛФ Определение нуклеотидфосфатазной активности ЛФ проводили согласно работе [12]. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ MgCb, 0.3 мМ ЭДТА, 10"6-102 М [y-32P]NTP, [p-32P]NDP или [a-32P]NMP (1-Ю7 имп/мин). Реакцию начинали добавлением ЛФ до конечной концентрации белка в смеси 1.5-2.5 мкМ. После инкубации в течение 1-3 ч при 37С аликвоты смеси (3 мкл) наносили на пластинки ПЭИ-целлюлозы (в случае NTP) или Kieselgel (в случае NMP), после чего проводили восходящую тонкослойную хроматографию в системе 0.25 М калий-фосфатного буфера, рН 7.0. и в системе диоксан: аммиак: вода (5:1:4) соответственно. Пластины сушили и радиоавтографировали. Степень гидролиза нуклеотида определяли по соотношению радиоактивной метки в пятнах, соответствующих контрольным нуклеотидам и ортофосфату. 2.2.14. Определение амилолитической активности ЛФ Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 30 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ NaN3, 1-5 мМ 4,6-зтилиден(07)-«-нитрофенил-(Оі)-а,0-мальтогептаозид или мальтоолигосахарид. Реакцию начинали добавлением ЛФ до конечной концентрации белка в смеси 1-Ю мкМ. После инкубации в течение 1-2 ч при 37С аликвоты смеси (3 мкл) наносили на пластинки Kieselgel и проводили восходящую тонкослойную хроматографию в системе этанол: бутанол: вода (2:2:1). Пластины сушили, обрабатывали 5% серной кислотой и снова сушили при 110С для визуализации продуктов гидролиза, как описано в работе [155]. Удельная единица активности была определена, как количество белка, приводящее к образованию 1 мкМ продуктов гидролиза олигосахаридов за 1 мин при 37С. 2.2.15. Определение каталитических активностей ЛФ in situ ДНК- и РНК-гидролизующие активности ЛФ определяли с помощью SDS-электрофореза в 12% ПААГ, содержащем сополимеризованные в гель 5-20 мкг/мл ДНК тимуса теленка или 20 мкг/мл суммарной РНК дрожжей по аналогии с работой [156]. После электрофоретического разделения белков в геле, проводили отмывку геля от SDS в течение 1 ч с помощью 4 М раствора мочевины, а затем водой (10 смен воды по 5-7 мин каждая). Для ренатурации белка и восстановления каталитических активностей ЛФ гель инкубировали в буфере: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 5 мМ MgCb, 1 мМ ЭДТА в течение 16 ч при 37С, после чего окрашивали бромистым этидием. Участок геля, где происходило расщепление ДНК или РНК, выявлялся в виде темного пятна на равномерно флуоресцирующем фоне. Положение белковых полос определяли по окраске геля кумасси R-250. Нуклсотидфосфатазную активность ЛФ определяли с помощью SDS-электрофореза в 12% ПААГ, содержащем [у-32Р]-меченые нуклеотиды (10 МБк). В процессе полимеризации геля происходило ковалентное присоединение нуклеотидов к гелю (радикальные процессы, обусловленные радиолизом нуклеотидов и присутствием соединений, инициирующих радикальные процессы полимеризации геля). После электрофоретического разделения белков в геле, проводили отмывку геля от SDS в течение 30 мин с помощью 0.5% раствора тритона Х-100, а затем водой (5 смен воды по 5 мин каждая). Для ренатурации активности ЛФ гель инкубировали в буфере: 20 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 5 мМ MgCb, в течение 16 ч при 37С, после чего радиографировали. Участок геля, где происходило отщепление концевого фосфата от ковалентно связванных с гелем нуклеотидов, выявлялся в виде светлого пятна на темном фоне. Положение белковых полос определяли по окраске геля кумасси R-250. Фосфатазную и амилолитичсскую активности ЛФ анализировали с использованием 12% ПААГ без субстрата. После электрофореза SDS удаляли так же, как при анализе ДНКазной активности. Гель нарезали полосками размером 2 мм, которые помещали в отдельные пробирки и тщательно размельчали. В пробирки добавляли по 50 мкл 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, и инкубировали их в течение 12-24 ч при 37С. Гель удаляли с помощью цетрифугирования и аликвоты элюата (5-10 мкл) использовали для определения фосфатазной и амилолитической активностей, как описано выше в п. 2.2.11. и 2.2.14. 2.2.16. Определение кинетических параметров реакции гидролиза Все измерения проводили на линейных участках зависимости накопления продуктов гидролиза пуклеотидов и олигосахарида от времени и концентрации ЛФ. Определение величин Км проводили в описанных выше в п. 2.2.11.-2.2.14. условиях, варьируя концентрацию пуклеотидов в диапазоне 10"6—10"2 М и мальтогептазида 10"4—10"2 М. Величины Км и Vmax был и оценены с помощью прямого линейного графика Эйзенталя и Корниш-Боуден [157], а также с помощью нелинейной регрессии с использованием программы "Origin". Данные, полученные с помощью указанных подходов, отличались в пределах ошибки определения этих величин, которая не превышала 10-30%. 2.2.17. Измерение спектров кругового дихроизма (КД) Спектры кругового дихроизма снимали с помощью спектрополяриметра J-600 ("Jasko", Япония). Длина оптического пути составляла 1 см, все измерения проводили при 37С, смеси содержали 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Получены спектры следующих растворов: ЛФ в концентрации 10"6 М, концентрацию АТР изменяли в диапазоне от 5-Ю"7 М до 1.6-10 5 М (при каждом шаге концентрация увеличивалась в два раза). При измерении спектров смесей ЛФ и АТР, концентрация белка была постоянной и равной 10 6 М, а АТР при тех же концентрациях, что и при измерении спектров в отсутствие белка. При расчете спектров смеси ЛФ и АТР вычитали соответствующий спектр раствора АТР и фоновый спектр буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5)
Нуклеазная и ДНК-фосфатазная активности изоформ ЛФ
Исследования ДНК-гидролизующей активности ЛФ проводили с использованием в качестве субстратов как высокомолекулярных ДНК (ДНК фага X, ДНК плазмиды pBR 322), так и олигодезоксирибонуклеотидов различной структуры и длины. РНК-гидролизующую активность исследовали только с использованием олигорибонуклеотидов (рис. 13). В качестве олигонуклеотидных субстратов использовали гомоолигодезокси- и гомоолигорибонуклетиды с различным числом звеньев (п = 8-10) такие, как d(pT),„ d(pA)n, d(pC)n, r(pU)n, r(pA)n, r(pC)n.
Исследования активностей были проведены для всех пяти изоформ ЛФ. Было обнаружено, что ЛФ при взаимодействии с олигонуклеотидами обладает двумя активностями - нуклеазпой (гидролиз межнуклеозидных фосфодиэфирных связей) и ДНК-фосфатазной (отщепление 5 -концевого фосфата олигонуклеотидов). Из данных, представленных на рис. 9 видно, что изоформа ЛФ-1 обладала наиболее высокими удельными активностями в гидролизе ДНК и РНК, а изоформа ЛФ-3 проявляла наибольшую фосфатазную активность. Основная часть белка (названная изоформой ЛФ-5), проявляя высокое сродство к сорбенту, практически не обладала способностью катализировать гидролиз ДНК и РНК и не проявляла ДНК-фосфатазной активности. Распределение активностей не коррелирует с хроматографическим профилем оптического поглощения белка при хроматографии на голубой сефарозе, а профили ДНКазной, РНКазной и фосфатазной активностей значительно отличаются друг от друга.
При определении количественных характеристик каталитической функции белка были использованы препараты ЛФ, обладающие максимальными ДНК- и РНК-гидролизующими активностями (изоформа ЛФ-1, рис. 9). Гидролиз дезоксирибо-ON с помощью ЛФ протекал значительно медленнее, чем высокомолекулярных ДНК-субстратов. Заметный уровень ЛФ-зависимой деградации ДНК фага X наблюдали уже через 20-30 мин инкубации, а эффективный гидролиз дезоксирибо-ON происходил только через 2-4 ч. Исследуемая фракция ЛФ содержала небольшое количество ионов железа, поскольку в молоке человека насыщение белка железом не превышает 10% [28].
Насыщение суммарной фракции ЛФ (после стадии хроматографии на гепарин-сефарозе) ионами Fe3+ с последующим удалением их избытка хроматографией на фосфоцеллюлозе не изменило ферментативных свойств ЛФ (рис. 14), что свидетельствовало о независимости нуклеазной функции ЛФ от ионов железа.
Оптимальное значение рН реакционной смеси при гидролизе ДНК оценено близким 7.0-7.5. Эта величина сопоставима с рН оптимумом ДНКазы 1 крови человека, однако значительно превышает значение рН оптимума другой известной ДНКазы: 5.0-5.5 у ДНКазы II [167]). При гидролизе дезоксирибо-ON рН-оптимум нуклеазной реакции был смещен в щелочную область, а для реакции отщепления концевого фосфата -в кислую. Кроме того, ранее с использованием нефракционированного ЛФ было показано, что по таким свойствам, как активация каталитической функции низкомолекулярными эффекторами и ионами металлов, ЛФ существенно отличается от других ферментов с ДНКазной активностью [11]. В случае РНКазной активности также показаны значительные отличия субстратной специфичности нефракционированных препаратов ЛФ и РНКазы А, а также других известных РНКаз крови и молока человека [11].
Совокупность данных, полученных в настоящей работе и описанных ранее [11], свидетельствует о том, что ДНКазная и РНКазная активности ЛФ существенно отличаются от таковых для известных ДНКаз и РНКаз. Таким образом, эти результаты подтверждают, что ДНКазная и РНКазная активности являются собственным свойством лактоферрина молока человека и не принадлежат никаким примесным ферментам. При этом различные изоформы белка, полученные хроматографией на голубой сефарозе, имели различный уровень каталитической активности (ДНК-, РНК- гидролизующей или ДНК-фосфатазной).
Ранее методом флуоресцентного титрования было показано, что ЛФ взаимодействует с ATP [34]. Семенов Д. В. также показал принципиальную возможность ЛФ-зависимого гидролиза АТР [12]. В настоящей работе проведен детальный анализ взаимодействия ЛФ и его изоформ с АТР и другими нуклеотидами, а также впервые исследована субстратная специфичность белка-фермента в гидролизе различных пуклеотидов. Показано, что лактоферрину, помимо АТРазной активности, принадлежит активность, отщепляющая фосфатную группу от любых рибо- и дезоксирибонуклеозид-MOHO-, ди- и трифосфатов. ЛФ обладает нуклеозидтрифосфатазиой активностью -гидролизует любые рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты до нуклеозиддифосфата и ортофосфа, а также нуклеотидазной (или нуклеотидфосфорилазной) активностью -дефосфорилирует рибо- и дезоксирибонуклеозидмонофосфаты. Кроме того, ЛФ катализирует гидролиз рибо- и дезоксирибонуклеозиддифосфатов до нуклеозидмонофосфата и ортофосфа. Таким образом, ЛФ обладает свойствами неспецифической нуклеозид-5 -моно-, ди- и трифосфатфосфатазы, которую назвали нуклеотидфосфатазой. В данном разделе при характеризации различных изоформ ЛФ рассмотрены только результаты по гидролизу пуклеотидов, а данные по их связыванию представлены далее.
Исследования нуклеотидфосфатазной активности ЛФ проводили с использованием в качестве субстратов нуклеозид- моно-, ди- и трифосфатов. ЛФ сохранял способность гидролизовать АТР на всех стадиях выделения, включая хроматографию на гепарин-сефарозе, хроматографию на сорбенте с иммобилизованными антителами к ЛФ человека и хроматографию на голубой сефарозе (рис. 7-9). На первом этапе был проведен анализ способности субфракций ЛФ, соответствующих белковым пикам 1-4 (рис. 9), гидролизовать АТР (рис. 15, а). Белок первого пика ЛФ не обладал ни высоким сродством к сорбенту, ни каталитической активностью. Максимальная АТР-гидролизующая активность соответствовала второму пику белка. Четвертый пик ЛФ, с максимальным сродством к голубой сефарозе, также обладал значительным уровнем этой каталитической активности. Третий пик белка был каталитически не активен. Относительное количество белка и его относительная активность (рис. 9, 15, л) в гидролизе АТР сильно зависели от донора молока, но все исследованные препараты ЛФ демонстрировали все четыре пика белковой плотности и два пика АТРазной активности.
Анализ возможной природы нуклеотид-связывающих центров ЛФ
Одной из задач данного исследования был анализ возможной роли обнаруженных трех центров ЛФ, взаимодействующих с нуклеотидами, в исключительной полифункциональности этого белка. Так как ЛФ обладает не только связывающей, но и нуклеотид-гидролизующей активностью, был проведен анализ зависимости скорости ЛФ 49 зависимого гидролиза [у- Р]АТР от концентрации нуклеотида при изменении последней от 10" до 10" М. Было показано, что заметного гидролиза нуклеотида при изменении концентрации в диапазоне от 10"6до 10"5 М не происходит (данные не приведены). Это свидетельствует о том, что центр повышенного сродства ЛФ к АТР ( 10 М) гидролитической функцией не обладает.
Заметный гидролиз [у-32Р]АТР лактоферрином происходил при изменении концентрации нуклеотида в диапазоне 10-4—5-1 О 3 М. Поскольку величина Км для АТР в реакции ЛФ-зависимого гидролиза нуклеотида (Км = 2.4-10"4 М, см. п. 3.2.3.2.) сопоставима с величиной K j комплекса ЛФ с АТР (IQ = (2.7±0.3)Т0"4 М), по-видимому, в этом центре ЛФ происходит не только связывание, но и гидролиз АТР. Поскольку гидролиз АТР наблюдается также при более высоких концентрациях нуклеотида ( 5-10"3 М), вопрос о возможности гидролиза АТР не только во втором (-10"4 М), но и в третьем центре, обладающем самым низким сродством к пуклеотиду ( 10"3 М), пока остается открытым. Это связано с тем, что активность этого центра в гидролизе АТР может быть существенно ниже, чем для второго центра среднего сродства. Получение ответа на этот вопрос возможно только после специфического блокирования ферментативного центра, связывающего АТР со сродством порядка 10"4 М. В то же время, наличие двух величин Км для ADP (см. п. 3.2.3.2.), может указывать на то, что в центре связывания ДНК осуществляется гидролиз не только ДНК, но и нуклеотидов, или, по крайней мере, некоторых из них со скоростью, сопоставимой с таковой для второго центра.
Принято считать, что ферменты, узнающие протяженные двухцепочечные нуклеиновые кислоты, не способны эффективно взаимодействовать с минимальными лигандами типа dNMP, короткими или длинными одноцепочечными олигонуклеотидами. Однако в нашей лаборатории была проанализирована эффективность взаимодействия большого числа ферментов репликации, репарации, рестрикции, топоизомеризации и интеграции с dNMP (для обзора см. [189-191]). Было показано, что любой фермент, узнающий специфические или неспецифические молекулы ДНК, с определенной эффективностью способен связываться с dNMP и их структурными компонентами, моделирующими отдельные элементы нуклеотидных звеньев ДНК [190]. При этом эффективность взаимодействия ферментов с dNMP в качестве минимального лиганда может быть выше или ниже эффективности взаимодействия с ДНК, но во всех случаях отношение величин Kd для dNMP и протяженных ДНК отражает способность ферментов дискриминировать короткие и длинные ДНК-лиганды [189].
Принимая во внимание эти данные, а также наличие у ЛФ двух центров связывания ДНК [122], можно предположить, что нуклеотиды могут взаимодействовать с ДНК-связывающими участками ЛФ, изменяя при этом собственную флуоресценцию белка. Исследование влияния нуклеотидов на комплексообразование ЛФ с d(pT)io и ЛФ зависимый гидролиз ON показали, что в случае АТР активация связывания и гидролиза ON набюдается при концентрациях нуклеотида 1-10 мкМ и 0.2-1 мМ (рис. 22 и 23, а). Эти величины соответствуют величинам Kj, характеризующим высоко и средне аффинные нуклеотид-связывающие центры ЛФ. Следовательно, в случае этих двух АТР-связывающих центров белка не происходит конкуренции нуклеотида и ДНК за фермент. Активация гидролиза ДНК при насыщении АТР этих центров ЛФ может быть обусловлена рядом различных причин, например, аллостерическим влиянием АТР на конформацию отдельных субъединиц олигомера или на олигомерное состояние белка. Этот вопрос требует дальнейшего детального анализа. Следует подчеркнуть, что, начиная с концентраций АТР, равных 2-3 мМ, наблюдалось ингибирование ДНК-связывающей и гидролизующей активностей ЛФ. Концентрация АТР, при которой происходит ингибирование комплексообразования ЛФ с ДНК на 50 %, равна приблизительно 3 мМ. Эта величина сопоставима с величиной Kd (1.6-10 3 М), характеризующей взаимодействие АТР с низко аффинным участком ЛФ. Следовательно, при концентрациях порядка 10"3 у М, АТР, скорее всего, взаимодействует с участком ЛФ, предназначенным для узнавания ДНК.
Для других нуклеотидов наблюдается подобная ситуация. Связывание нуклеотидов с высоко и средне аффинными центрами ЛФ в большинстве случаев ведет к активации комплексообразования ЛФ с d(pT)io и гидролиза ON, тогда как при концентрациях, сопоставимых с величиной третьей Kd (низко аффинный центр ЛФ) во всех случаях происходит ингибирование комплексообразования и ДНКазной активности. Эти данные также свидетельствуют в пользу взаимодействия нуклеотидов при высокой концентрации с ДНК-связывающим центром ЛФ.
Таким образом, все три нуклеотид-связывающих центра ЛФ могут выполнять различные функции. Взаимодействие нуклеотидов со средне аффинным участком ЛФ (Kd для АТР -10"4 М) активирует ДНК-связывающую и гидролизующую активности ЛФ. Кроме того, этот центр ЛФ обладает нуклеотид-гидролизующей активностью. При высоких концентрациях порядка 10"-10" М нуклеотиды конкурируют с ДНК за связывание с ЛФ. Рассмотренные выше данные не дают ответа на вопрос о возможной роли высоко аффинного центра ЛФ в его функционировании, этот вопрос будет рассмотрен ниже.
