Введение к работе
Актуальность.
Магнитный изотопный эффект (МИЭ), описанный в работах [А.Л. Бучаченко и соавт, 2005-2014; Amirshahi et al., 2008-2011; Sarkar et al., 2008-2011], дает возможность контроля каталитической активности металлоферментов, осуществляемого путем замены немагнитных изотопов металлов на магнитные, т.е. на изотопы тех же элементов, но с некомпенсированным ядерным спином. Так, эксперименты с заменой природного пула изотопов магния ( Mg) на его магнитный
изотоп ( Mg), а также на различные изотопы цинка в молекулах киназ и ДНК-полимераз, показали перспективность таких исследований [Buchachenko et al., 2008 - 2013; А.П. Орлов и соавт, 2012].
Актуальность данной работы, таким образом, определяется
фармакологическим потенциалом, скрытым самой возможности ядерно-
магнитного управления металл-зависимыми процессами репликации и репарации ДНК с помощью ионов парамагнитных изотопов двухвалентных металлов, входящих в состав каталитических сайтов соответствующих ферментов. Такая возможность показана в работах [А.Л. Бучаченко и соавт, 2005-2013; Sarkar et al., 2007-2011; Amirshahi et al., 2008-2011].
Актуальность настоящей работы связана также и с тем, что избирательная доставка магнитных изотопов магния и цинка в клетки ряда опухолей может эффективно обеспечиваться с помощью нанокатионитов фуллерен - порфириновой природы типа РМС16 [Amirshahi et al., 2009; Rezayat et al., 2010; Kuznetsov et al., 2010]. К числу таких опухолей относится острый миелоидный лейкоз человека [Orlova et al., 2012], в клетках которого имеет место гиперэкспрессия ДНК-полимераз Р, отвечающих за репарацию поврежденных участков ДНК, что, по мнению некоторых фармакологов, делает молекулы этих ферментов легитимными мишенями для атаки со стороны ингибирующих цитостатиков [Dalai et al., 2008; Mizushina 2009; Martin et al., 2010]. При этом внедрение ионов магнитного изотопа Са в каталитические сайты этих ферментов до сих пор не исследовалось.
Поскольку механизм действия последних может включать в себя магнитные изотопные эффекты, поиск возможных способов фармакологического применения
этих эффектов следует признать целесообразным и, следовательно, актуальным.
Цель исследования.
Оценка возможной роли магнитного изотопного эффекта катионов Са в регуляции талитической тивности ДНК-полимеразы Р как фактора цитостатического воздействия на клетки ОМЛ человека HL-60.
Задачи исследования.
1. Разработка методики выделения и очистки ДНК-полимеразы Р из хроматина
клеток HL-60.
2+ 25 2+ 2+ 43 2+
2. Изучение влияния катионов *Mg , Mg , *Са и Са на каталитическую
активность и эффективность (точность) функционирования ДНК-полимеразы Р
из клеток HL-60.
т? 2+
3. Оценка влияния низких концентраций t е и эндогенного железа в различных
25 2+ 43 2+
клетках и тканях на проявление магнитных изотопных эффектов Mg и Са в реакциях металл - зависимого биологического фосфорилирования нуклеотидов.
2+ 25 2+ 2+ 43 2+
-
Изучение влияния *Mg , Mg , *Са и Са - переносящих фуллерен-порфириновых наночастиц РМС16 на выживаемость и апоптоз клеток HL-60.
-
Поиск и анализ возможных корреляций между найденными параметрами магнитных изотопных эффектов, апоптозом и выживаемостью клеток HL-60.
43 2+
Оценка фармакологического потенциала магнитного изотопного эффекта Са .
Научная новизна.
В настоящей работе впервые осуществлено:
1. Выделение ДНК-полимеразы Р из хроматина клеток линии HL-60 и изучение ее
физико-химических и каталитических особенностей.
*/~< 2+ 43/—ч 2+ 43/—ч 2+
2. Изучение влияния изотопов Са (0.135 % Са ) и Са на каталитическую
активность ДНК-полимеразы Р из HL-60.
*/"< /^1 43/—ч /-Ч */-( ГЦ/|Л 43 /-( min
3. Изучение влияния СаСІ2, СаСІ2, ( Са)4гМС16 и ( Са)4гМС16 на показатели
апоптоза и выживаемости клеток HL-60.
4. Ожидаемые результаты могут впервые позволить определить направления и способы применения стабильного магнитного изотопа кальция в исследованиях, проводящихся в областях биохимии канцерогенеза, молекулярной фармакологии и экспериментальной онкологии.
Начно-практическая значимость.
-
Предложенная методика выделения и очистки ДНК-полимеразы из хроматина клеток ОМЛ вляется вкладом арсенал препаративной биохимии, позволяющим повысить эффективность исследований в таких областях как биохимия, молекулярная фармакология, экспериментальная онкология.
-
Полученные результаты создают основу ля ланирования дальнейших
исследований роли МИЭ - Ca в обеспечении цитостатического воздействия
43 2+
комплекса PMC16- Ca на клетки ОМЛ, что может способствовать созданию нового эффективного подхода к химеотерапии опухолей.
3. Данные работы уточняют современные представления молекулярных
механизмах репарации ДНК и о возможностях фармакологического влияния на
этот процесс в опухолевых клетках.
Апробация диссертации.
Результаты работы доложены и обсуждены на VII Международной Научной Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых медицинских ВУЗов в РНИМУ им. Н.И. Пирогова (Москва, 2012); на 2-ом Международном конгрессе по изучению и терапии рака (Сан-Антонио, США, 2012); на 4-ом Европейском симпозиуме по эпигеномике рака (Ситжес, Испания, 2013). На 49-ой ежегодной Конференции Королевского Общества фармакологов и токсикологов (Бирмингем, Великобритания, 2013) работа удостоена Диплома 3й степени.
Структура и объем диссертации.
Материалы диссертации изложены на 118 страницах, включая иллюстрации: 8 таблиц, 25 рисунков. Диссертация остои из введения, обор лиературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы включающего 237 ссылок.